Application Note UV吸光度測定におけるマイクロプレート素材の影響

はじめに

Marie Pape-Bub｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラーデバイス

吸光度測定に使用されるマイクロプレートは、一般的にポリスチレン、環状オレフィン共重合体（COC）、または石英で製造されています。これらの素材は、可視光領域（400～700 nm）での測定にはいずれも適していますが、紫外線（UV）領域（400 nm未満）では、一部の素材が光を吸収するため、DNA、RNA、タンパク質の260 nmや280 nmでの直接定量など、吸光度測定に基づくアプリケーションには不向きです。UV吸光度測定に適したマイクロプレート素材の選択は非常に重要であり、素材によって透過特性が異なります。多くのマイクロプレートに使用されている標準的なポリスチレンはUV領域で光を吸収し、高いバックグラウンドを生じさせます。UV領域でのバックグラウンドを最小限に抑えるために、石英、COC、またはフルオロカーボン（FC）などの「UV透過性」プラスチック製マイクロプレートがよく使用されます。

本テクニカルノートでは、SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダーを用いて、ウェル底面（マイクロプレートリーダーによる測定時に光が通過する面）がポリスチレン、COC、またはFCで構成された複数のマイクロプレートのUV吸光度を評価しました。比較のために、2～4 µLのサンプルを2枚の石英スライドの間に配置して測定するホルダーで構成されたSpectraDrop 微量サンプル測定プレートも含めました。また、マイクロプレート用のリッド（蓋）およびヒートシールについても、UV吸光度の観点から評価を行いました。

材料

装置

• SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
• 4s3™ 半自動シートヒートシーラー（Brooks Life Sciences）

マイクロプレート

• SpectraDrop 微量サンプル測定プレート (モレキュラーデバイス)
• UltraVision™ プレート 384 (Brooks Life Sciences )
• UltraVision プレート 96 (Brooks Life Sciences )
• Vision Plate 384 (Brooks Life Sciences ) 
• Vision Plate 96 (Brooks Life Sciences )
• μClear UV-Star (Greiner Bio-One )
• μClear UV-Star (Greiner Bio-One )
• μClear CELLSTAR（Greiner Bio-One）
• Nunclon Delta Surface（サーモフィッシャーサイエンティフィック）

マイクロプレートカバー

• ユニバーサルマイクロプレートリッド (Brooks Life Sciences)
• クリアヒートシール (Brooks Life Sciences )

表1. 評価対象のマイクロプレートおよびプレートカバーの特長。SpectraDrop 微量サンプル測定プレートは、24または64のサンプルポジションを持つ2枚の石英スライドをホルダーに収めた構造で、各ポジションに2または4 µLのサンプルを保持できます。

方法

各種マイクロプレートの低波長域における光学的透明性を評価するため、各プレートの1ウェルに蒸留水を充填しました（96ウェルプレートには100 µL、384ウェルプレートには20 µL）。その後、200～400 nmの範囲で1 nm刻みの吸光度測定を行いました。すべての波長スキャンは、SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダー（バンド幅2 nm）とSoftMax Pro ソフトウェアを使用して実施しました。プレートカバーの影響を評価するため、UltraVision™ 96ウェルマイクロプレート（クリアな側壁と超高透明な底面）を以下の条件で測定しました：(a) カバーなし、(b) クリアな Universal Microplate Lid を装着、(c) Clear Heat Seal で密封（4s3™ 半自動シートヒートシーラーを使用し、メーカーの指示に従って処理）

結果

スペクトルスキャンの結果は図1および表2に示されています。すべてのプレート素材は、予想通り340 nm以上の可視光領域では低い吸光度を示しましたが、低UV領域（200～280 nm）および高UV領域（280～340 nm）では、素材ごとに吸光度に大きな違いが見られました。

表2. 各種プレート素材の選択波長における光学濃度。表に示された吸光度の値は、各種プレートおよびカバーに対して実施したスペクトルスキャンから取得したものです。

低UV領域では、石英、FC（フルオロカーボン）、COC（環状オレフィン共重合体）ベースのマイクロプレート素材が最も優れた性能を示しました。特に200～230 nmの範囲で大きな違いが見られました。図1の拡大図（200～240 nm）では、吸光度の違いが明確に示されています（図1, B）。石英スライドを使用したSpectraDrop 微量サンプル測定プレートは、200 nmでのバックグラウンド吸光度が0.2 ODと最も低い値を示しました。クリアなUltraVision FC 96ウェルマイクロプレート（FC_UltraVision（クリア、96））は、200 nmで0.3 ODの吸光度を示し、評価対象の中で最も良好な性能を示しました。COC製のμCLEAR UV STAR 96ウェルおよび384ウェルプレートは、200 nmで1.2 ODのバックグラウンド吸光度を示し、230 nmでは0.1 ODまで低下しました。一方、同じくCOCベースのUltraVision 384ウェルマイクロプレートは、200 nmで2 ODの吸光度を示し、230 nmでは0.2 ODまで低下しました。

その他の評価対象プレートおよびカバーは、280 nm未満の波長で2.5 ODを超える吸光度を示し、低UV領域でのアッセイには不適合であることが判明しました。これらのプレートおよびカバーは、280 nm以上の波長での使用には適している可能性があります。

μCLEAR CELLSTAR 細胞培養用マイクロプレートおよび黒色側壁・透明底面のポリスチレン製 Vision Plate のスペクトルスキャンでは、200 nmで3.6 ODの吸光度を示し、280 nmで急激に低下し、320 nmで最小値に達しました（図1, A）。もう一つの細胞培養用プレートであるNunclon Delta Surface プレートは、200 nmで3.8 ODの吸光度を示し、310 nmで最小値に達しました。LDHアッセイ、NAD/NADHアッセイ、LAL法によるエンドトキシンアッセイなど、340 nmで測定されるアッセイには、これらのプレートを使用することで正確な測定が可能です。

一部のアッセイでは、ウェル間の汚染や蒸発を防ぐためにマイクロプレートにカバーを装着する必要があります。さまざまなタイプのプレートカバーが市販されており、本評価ではポリエステル製ヒートシールとポリスチレン製ユニバーサルリッドをテストしました。表2に示す通り、両者とも200～260 nmの範囲で3.6～4 ODの吸光度を示しました。全体として、ポリエステル製ヒートシールは260 nm以上の波長でより低い吸光度を示し、両カバーとも320 nm以上では吸光度が大幅に低下しました。これらのプレートカバーは、320 nm以上で測定されるアッセイには適していると考えられます。

結論

本テクニカルノートで示したマイクロプレートおよびプレートカバーの比較は、UV領域における素材の違いが吸光度に与える影響を明らかにしています。素材によっては、バックグラウンド吸光度が高くなる場合があるため、特定の波長または波長範囲でアッセイを実施する際には、使用するマイクロプレートやカバーの空ウェル（バッファーまたは水のみ）の吸光度を事前に確認し、適合性を評価することが重要です。たとえば、DNAやRNAの直接定量（260 nmおよび280 nmで測定）に使用するマイクロプレートは、これらの波長での吸光度が最小であることを確認する必要があります。

一般的に、各マイクロプレートのメーカーが推奨する使用条件を遵守することが重要です。たとえば、Greiner社はμCLEAR UV STARプレートの最適な使用範囲を230 nmまでとしていますが、本評価では220 nmまで吸光度が低いことが確認されました。

通常のポリスチレン製マイクロプレートをUV波長でのアッセイに使用すると、結果に悪影響を及ぼす可能性があります。本評価では、SpectraDrop 微量サンプル測定プレートの石英スライド（2 µLおよび4 µLのサンプル測定が可能）が、他の素材と比較してUV領域で最も低いバックグラウンド吸光度を示しました。UV領域での一般的なアッセイ容量の測定には、FCまたはCOC製マイクロプレートが、石英に代わる低コストかつ低吸光度の選択肢となります。