Application Note EarlyTox細胞生存能アッセイキットを用いた
GM-CSFおよびTNFα誘導アポトーシスの評価

はじめに

腫瘍壊死因子α（TNFα）は主要な炎症性サイトカインの一つであり、いくつかの細胞経路において様々な事象を調節する。TNFαは、細胞内カスパーゼカスケードの活性化を介して、U937のような造血細胞のアポトーシスを誘導することが知られている。一方、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）は、増殖や分化を促進する造血成長因子の一つである。しかし、U937細胞はGM-CSFに応答して増殖抑制やアポトーシスを示すことが報告されている。TNFαとGM-CSFはともにU937細胞にアポトーシスを誘導するが、その時間経過はこれら2つのサイトカイン間で異なるようであった。2つのサイトカインを併用すると、高い相乗効果が観察された。

EarlyTox™細胞生存能キットは、生存率や様々なアポトーシスイベントを含む様々な細胞状態を評価するための試薬ファミリーです。これらの試薬は、蛍光マイクロプレートリーダーに最適化された均一性無洗浄アッセイ用に設計されています。ここでは、Live/Dead Assay、Caspase-3/7 R110 Assay、Caspase-3/7 NucView 488 Assayの3種類のキットを用いて、U937細胞に対するTNFαおよびGM-CSF処理の影響を測定した（図1）。

• EarlyTox™ 生細胞/死細胞アッセイキットには、哺乳類細胞での使用に適した2種類の生細胞/死細胞マーカーが封入されています。カルセインAMは広く使用されている生細胞マーカーであり、エチジウムホモダイマー-III（EthD-III）は損なわれた膜から細胞に入り、DNAに結合して死細胞で明るい赤色蛍光を発します。
• EarlyTox™ Caspase-3/7 R110 Assay Kitは、アポトーシスプロセスのエンドポイント解析のために細胞溶解を必要とするワンステップの均一性アッセイを提供します。
• EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488 Assay Kitは、NucView 488 Caspase-3基材を使用することにより、インタクトな細胞集団におけるアポトーシスの検出を可能にします。この試薬は細胞に対して毒性がなく、アポトーシスのカイネティクス研究に使用できます。

この細胞ベースの試験では、SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダーを用い、ウェルスキャン機能で底から蛍光シグナルを測定しました。この機能は、潜在的な細胞増殖の不均一性によるウェル間のばらつきを避けるため、ウェルの底を横切る12点（ユーザー定義可能）のシグナルを平均化します。

材料

• U937細胞（ATCC Cat.# CRL-1593.2）
• サイトカイン
  ◦ヒト TNFα (Peprotech Cat# 300-01)
  ◦ヒト GM-CSF (Peprotech Cat# 300-03)
• EarlyTox 細胞生存能試薬（モレキュラーデバイス社）：
  ◦EarlyTox Live/Dead Assay Kit (Cat.# R8340)
  ◦EarlyTox Caspase-3/7 R110 Assay Kit (Cat.# R8346)
  ◦EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488アッセイキット (Cat.# R8348)
• PBS
• 96ウェル、フラット、クリアボトム、黒色TC処理マイクロプレート（Corning cat.）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーおよびSpectraMax® MiniMax 300イメージングサイトメーター

方法

細胞の培養と処理

U937セルは、10％FBSとペニシリン／ストレプトマイシンを添加したRPMI1640培地で培養した。

実験当日、セルは100,000個/80μL/ウェルで播種した。20μLの5倍濃度のサイトカインを各ウェルに加え、最終濃度を1倍、容量を100μLとした。処理は5% CO2、37℃のインキュベーターで24時間または48時間行った。

細胞生存率およびアポトーシスアッセイ

処理後、試薬を調製し、以下のように各ウェルに添加した。

ライブ／デッドアッセイ用： カルセインAM/EthD-IIIの2X作業溶液は、カルセインAMとEthD-IIIのストック溶液をPBSに加え、各色素の濃度が6μMになるように調製した。100μLの2X作業溶液を各アッセイウェルに加え、最終容量を200μLとし、各染料の最終濃度を3μMとした。プレートを遮光し、室温で1時間インキュベートした。SpectraMax i3xリーダーで、表1に示した設定を用いて蛍光を測定した。

Caspase-3/7 R110アッセイ： 酵素基質（AC-DEVD）2-R110（2mM）を細胞溶解/アッセイバッファーに50μL/1mLの割合で加えて基質アッセイバッファーを調製した。100μLの基質アッセイバッファーを各ウェルに加え、最終体積をウェルあたり200μL、最終基質濃度を50μMとした。その後、サンプルを遮光して室温で1時間インキュベートした。SpectraMax i3xリーダーで、表1に示した設定を用いて蛍光を測定した。

Caspase-3/7 NucView 488アッセイ： NucView 488基質の10μM 2X作業溶液をPBSで調製した。100μLの作業用基材溶液を、100μLの細胞と培地を封じ込めたウェルに直接加え、最終濃度を5μMとした。セルを遮光し、室温で1時間インキュベートした。イメージングをSpectraMax MiniMaxサイトメーターで541 nmの緑色蛍光チャンネルを用いて行うか、SpectraMax i3xリーダーで検出した。プレートリーダーの設定については表1を参照のこと。

結果

その結果、TNFαで処理すると、U937細胞は用量依存的、時間依存的にアポトーシスを起こした。GM-CSFの処理は48時間までU937に影響を与えなかった。しかし、細胞をTNFαとGM-CSFの組み合わせでインキュベートすると、48時間後に明らかに相乗効果が観察された。GM-CSF単独では、カスパーゼ3様経路を介してU937細胞にアポトーシスを誘導することが、TNFαに比べて遅い時間経過（72時間後）で報告されているが、これら2つのサイトカインの相乗効果は24時間で観察された。我々の研究では、相乗効果は48時間まで明らかではなかった。図2-5を参照。

結論

アポトーシスの異なる出力値を測定する3つの異なる試薬を用いて、懸濁細胞のアッセイプロセスを簡略化する混合-測定プロトコルを実証した。SpectraMax i3xリーダーのウェルスキャン機能は、ウェル間のばらつきを低減し、ウェル間の細胞の不均一な増殖や分布を補正した。細胞生存率試薬ファミリーは、アポトーシスや細胞死に関連する細胞事象を研究するための様々なツールを研究者に提供する。

参考

顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によるヒト造血U937細胞のアポトーシス誘導：カスパーゼ3様経路の存在の可能性。白血病 (2000) 14, 612-619.

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