Application Note CatchPoint SimpleStep ELISAキットによる
ELISA結果の迅速化

はじめに

クリステン・ペニントン｜アソシエイトサイエンティスト｜Abcam
ジョナサン・ワグナー｜シニアリサーチアソシエイト｜Abcam
イェン・ウェン・チェン｜シニアサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
キャシー・オルセン｜Sr. アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

従来のサンドイッチELISAでは、マイクロプレートのウェルにコートされた捕捉抗体と、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）やアルカリホスファターゼ（AP）などの酵素に結合した検出抗体という、標的タンパク質に対する一対の抗体を用います。これらの酵素に使用される基質に応じて、結果は吸光マイクロプレートリーダーで吸光度または蛍光シグナルとして測定できる。

一般的な ELISA プロトコルは、インキュベーションや洗浄のステップを何度も行うため、時間がかかります。AbcamのSimpleStep ELISA®テクノロジーは、イムノアフィニティタグをプレコートしたマイクロプレートのウェルに抗体-分析物サンドイッチ複合体を形成し、捕捉することで、アッセイ時間を劇的に短縮します。このプロトコールでは、シグナルが発現するまでに1回のインキュベーションと1回の洗浄ステップが必要で、所要時間はわずか90分です（図1）。

CatchPoint® SimpleStep ELISA®は、CatchPoint色素Stoplight Redを使用し、蛍光ベースの検出を行います。蛍光アッセイは、定量上限および下限が向上し、より広いダイナミックレンジを提供します。また、蛍光シグナルはより安定しており、基質添加後 10 分から少なくとも 1 時間で検出が可能です。

材料

• キャッチポイント・シンプルステップELISAキット
  ◦ヒト Pro-Collagen I alpha 1 ELISA キット, 蛍光 (Abcam, ab229389)
  ◦ヒトアポリポ蛋白質A-IV蛍光ELISAキット (Abcam, ab229428)
  ◦ヒト TNF アルファ ELISA キット, 蛍光 (Abcam, ab229399)
  ◦マウス ヘムオキシゲナーゼ 1 ELISA キット, 蛍光 (Abcam, ab229431)
  ◦マウス MCP3 ELISA キット, 蛍光 (Abcam, ab229391)
  ◦マウス Pro-Collagen I alpha 1 ELISA キット, 蛍光 (Abcam, ab229425)
• シンプルステップELISAキット
  ◦ヒト プロコラーゲン I アルファ 1 ELISA キット (Abcam, ab210966)
  ◦ヒトアポリポ蛋白質A-IV ELISAキット (Abcam, ab214567)
  ◦ヒトTNFアルファELISAキット (Abcam, ab181421)
  ◦マウス ヘムオキシゲナーゼ 1 ELISA キット (Abcam, ab204524)
  ◦マウス MCP3 ELISA キット (Abcam, ab205571)
  ◦マウス プロコラーゲン I アルファ 1 ELISA キット (Abcam, ab210579)
• Molecular Devices マイクロプレートリーダー
  ◦SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー (cat. #ID5-STD)
  ◦SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダー（cat.）
  ◦SpectraMax® M4およびM5マルチモードマイクロプレートリーダー (cat.#M4またはM5)
  ◦FilterMax™ F5 マルチモードマイクロプレートリーダー (cat. #F5)

方法

標準曲線は各キットに付属のアッセイプロトコールに従って作成した。比色分析は10分後に停止した。蛍光シグナルは、Stoplight Red基質添加後10分および1時間後に測定し、停止液を添加する必要はなかった。

SpectraMax iD5 リーダー（SpectraMax iD3 リーダーも、SpectraMax iD5 リーダーと同じオンボード蛍光性能を持つため、これらのアッセイに適しています）、SpectraMax i3x、SpectraMax M4またはM5、FilterMax F5 マルチモードマイクロプレートリーダーで、同じアッセイプレートからの蛍光シグナルを測定しました。SpectraMax M4 リーダーは、吸光度および蛍光検出において SpectraMax M5 リーダーと特異性のない仕様でした。データの作成と解析には、最適化されたインストゥルメンテーション設定（表1）を備えた、事前設定済みのSoftMax® Proソフトウェアプロトコル（softmaxpro.orgで入手可能）を使用した。

表 1. CatchPoint SimpleStep ELISA 検出用の SpectraMax リーダー設定。SpectraMax iD5 および SpectraMax M5 リーダーはいずれもモノクロメーター ベースの光学系を使用するため、設定で光学構成を選択する必要はありません。SpectraMax i3x リーダーは、モノクロメーターまたはフィル ターを封じ込めた検出カートリッジを使用できます（CatchPoint SimpleStep ELISA 検出にはモノクロメーターで十分です）。FilterMax F5 リーダーは検出用にフィルターのみを使用します。

結果

図 2 に示されたデータは、蛍光 CatchPoint SimpleStep ELISA キットが、SimpleStep ELISA 吸光度アッセイキットと比較して、高いシグナルウインドウと広いダイナミックレンジを提供することを示しています。結果は、使用する特異性アッセイキットによって異なります。CatchPoint SimpleStep ELISAキットのSB比（S/B）は少なくとも1時間は安定していることが示されました。シグナル発現反応を停止させるステップを必要としない蛍光キットは、ユーザーが独自のアッセイに対して時間対シグナルを最適化することを可能にし、また読み出しの柔軟性を提供する。

CatchPoint SimpleStep ELISA 法やその他の蛍光アッセイの結果を異なる蛍光マイクロプレートリー ダーで検出すると、得られるシグナルの大きさが異なることがよくあります。図 3 に示すように、結果をシグナル／SB 比でプロットすると、テストしたすべてのリーダーでほぼ同じプロットが得られ、どのリーダーも CatchPoint SimpleStep ELISA の蛍光シグナルの検出に適していることが確認されました。

結論

CatchPoint SimpleStep ELISA キットは蛍光ベースで、吸光度ベースの SimpleStep ELISA キットよりもシグナルとダイナミックレンジが向上しています。CatchPoint SimpleStep ELISA キットは、従来の ELISA と比較して、結果を得るために必要な時間を約 3 分の 2 に短縮し、90 分の ELISA ワークフローを提供します。CatchPoint SimpleStep ELISAキットは、SpectraMaxおよびFilterMaxリーダーで検証されており、SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルを使用することで、アッセイを簡単に検出し、迅速に結果を得ることができます。

互換性のあるマイクロプレートリーダーの全リストをご覧ください。