Application Note SpectraDrop微量サンプル測定プレートを用いた
蛍光法による微量DNAサンプルの定量解析

はじめに

UV吸光度を用いたDNAの測定は、多くの種類のサンプルの定量を可能にする一般的な方法です。しかし、アプリケーションによっては、調製方法や原料の不足により、非常に少ないサンプル量や濃度の定量が必要となる場合があります。このようなアプリケーションでは、蛍光DNA定量法は感度が高く、より少量のサンプルで低濃度の定量が可能です。

モレキュラーデバイスのSpectraMax®マイクロプレートリーダー用SpectraDrop™微量サンプル測定プレートは、プレートあたり最大64サンプルと、他のどの低容量マイクロプレートよりもハイスループットを提供します。2 µLという低容量のサンプルを測定できます。SpectraDrop微量サンプル測定プレートには、特別に設計されたアダプターと光学的透明度の高いスライドベアが組み込まれており、吸光度モードと蛍光モードの測定が可能なため、ユーザーのアプリケーションニーズに対応できます（図1）。

図1. SpectraDrop微量サンプル測定プレートの構成。少量サンプル用スライドには、24または64サンプルを入れるスポットまたは「ウェル」を画定するマスクがあります。カバースライドには0.5 mmまたは1.0 mmのスペーサーがあり、それぞれ2 µLまたは4 µLのサンプルに対応します。

ここでは、プロメガ社のQuantiFluor dsDNAアッセイを低容量のマイクロプレートフォーマットにアダプターすることで、1サンプルあたり5 pg、つまり2.5 pg/µLの感度で、2µLという小さなサンプルを測定できることを示します。これは、感度が約2000 pg/µLに制限されるDNAの低容量吸光度定量よりも約1000倍感度が高く、吸光度法以上の感度を必要とする次世代シーケンシングなどのアプリケーションに最適です。

少量アッセイ手順

アッセイ手順は、少量セットアップ用に以下のように若干変更しました。1pg/µLから1000pg/µLまでの標準物質をTEバッファーで調製しました。8チャンネルピペッターを用いて、各標準物質2µLをSpectraDropボトムスライドのウェルにトリプリケートで滴下しました。その後、QuantiFluor dsDNA Dye作業溶液を2µLずつ、混合しながらサンプルにピペッティングし、1ウェルあたりの総サンプル量を4µLとしました。バックグラウンドの蛍光レベルを測定するために、緩衝液と色素を封じ込めたブランク複製液が含まれました。その後、カバースライドをサンプルの上に置き、プレートを読み取る前に暗所で5分間インキュベートしました。

プレートリーダーのセットアップ

SpectraDrop微量サンプル測定プレートを、フルオレセインフィルター付き蛍光強度検出カートリッジ（FI-FLRH）、またはシグナル/バックグラウンド最適化波長付きTunable Wavelength Selection（TUNE）カートリッジを使って、SpectraMax® Paradigm®マルチモードマイクロプレートリーダーで読み取りました。また、モノクロメーターベースのSpectraMax® M5e マルチモードマイクロプレートリーダーで、最適化された波長を使用して読み取りました。各装置の設定を表1に示します。

表1：QuantiFluorアッセイの装置設定。

すべてのデータの取得と解析には、SoftMax® Proソフトウェアを使用しました。SpectraDrop微量サンプル測定プレート用にあらかじめ設定されたQuantiFluorプロトコールにより、データの収集と解析が簡素化されました。SpectraDrop微量サンプル測定プレートの特異性定義もソフトウェアで利用でき、新しいプロトコルのセットアップを簡素化し、データの正確性を保証します。さらに、SpectraMaxマイクロプレートリーダーは、SpectraDrop微量サンプル測定プレートの最適化を可能にし、4つのコーナーサンプルのスキャンを使用してプレート定義を微調整し、より正確な結果を得ることができます。SpectraMax Paradigmマルチモードマイクロプレートリーダーでリードハイトの最適化を行い、シグナルの検出を最大化しました。

アッセイ直線性と感度

SpectraDrop微量サンプル測定プレートで検出されたQuantiFluorアッセイは、試験した標準物質の範囲（1～1000 pg/µL）で直線性を示し、標準曲線r2値は0.999でした（図2）。バックグラウンドの標準偏差の3倍を用いて算出した検出下限（LLD）は5 pg/ウェル、すなわち2.5 pg/µLでした。

図2. dsDNA standard curve SpectraDrop™微量サンプル測定プレートをSpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用しましたdsDNA standard curve。dsDNAの検出下限は5 pg/ウェル、すなわち2.5 pg/µLでした。 standard curve r² = 0.999。SpectraMax M5eマルチモードマイクロプレートリーダーでも同様の結果が得られました。

まとめ

少量のDNAサンプルを扱う研究者は、少量で高感度のフォーマットで定量する方法を必要とすることが多いです。SpectraDrop™微量サンプル測定プレートは、2.5 pg/µLという低濃度のDNAサンプルの測定を可能にし、低容量吸光光度法の1000倍の感度を実現します。QuantiFluor dsDNAアッセイとSpectraDrop微量サンプル測定プレートを併用することで、結果の正確性を犠牲にすることなく、サンプルロスを最小限に抑えることができます。

SpectraDrop微量サンプル測定プレートのスライドは取り扱いが簡単で、すべての光学面に手が届くので洗浄が容易です。スペーサーとスライドの設計により、ウェル間の均一性に優れているため、ウェル間のキャリブレーションは不要です。0.5mmまたは1.0mmスペーサー付きカバースライドと同様に、24ウェルおよび64ウェルサンプルスライドもあり、ユーザーのスループットとサンプル量のニーズに対応できます。SpectraDrop微量サンプル測定プレートは、SpectraMax Paradigmマルチモードマイクロプレートリーダーを含むSpectraMaxプレートリーダーおよびStakMax®マイクロプレートスタッカーと互換性があります。

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