Application Note 青色から赤色蛍光色素における
SpectraMaxマイクロプレートリーダーの蛍光感度評価

はじめに

Krystal Courtney D. Belmonte, PhD｜フィールドアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Christina Nadolny, PhD｜フィールドアプリケーションサイエンティストII｜モレキュラーデバイス

蛍光色素はそれぞれ固有の励起および発光スペクトルを有しており、これが測定の感度や精度に影響を及ぼす可能性があります。SpectraMax®マイクロプレートリーダーは、波長選択、バンド幅、励起・発光波長の組み合わせなど、装置構成や設定が異なっており、これらの違いが各種蛍光色素に対する性能に影響を与えます。検出下限（LLD）は、バックグラウンドノイズから信頼性をもって識別可能な蛍光色素の最小濃度を示す重要な指標であり、比較において中心的な役割を果たします。

本検討では、青色から赤色にわたる7種類の蛍光色素を対象に、SpectraMaxマイクロプレートリーダーの性能を比較し、線形範囲およびLLDなどの主要パラメータに焦点を当てて評価しました。

蛍光色素の標準液は、100 µMから0.001 pMまでの範囲で、Tris緩衝生理食塩水（TBS）中に段階希釈して調製しました。各標準液100 µLを黒色96ウェルマイクロプレート（Greiner、品番：655076）のウェルに分注し（各標準液につきn=4）、TBS緩衝液のみを含むブランクウェル（n=8）も準備しました。その後、各マイクロプレートリーダーに最適化された設定（表9）を用いて蛍光測定を行いました。標準曲線はSoftMax Proソフトウェアを使用して作成しました。各マイクロプレートリーダーの感度を評価するために、各蛍光色素のLLD（最小検出限界）を以下の式を用いて算出しました：

\( \text{LLD} = \frac{3 \cdot \text{SD}_{\text{blank}} \cdot \text{Concentration}}{\text{RLU}_{\text{sample}} - \text{RLU}_{\text{blank}}} \)

比較対象装置

• SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダー（TUNEモジュール搭載、モレキュラーデバイス #0200-7050）
• SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー
• SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
• SpectraMax® Mini マルチモードマイクロプレートリーダー（フィルターキューブ搭載、表10参照）
• SpectraMax® M5e マルチモードマイクロプレートリーダー
• SpectraMax® Gemini™ EM マイクロプレートリーダー

比較対象蛍光色素

• Alexa Fluor 350（Molecular Probes）
• クマリンB（Thermo Fisher）
• フルオレセイン（Invitrogen）
• Alexa Fluor 555（Molecular Probes）
• Alexa Fluor 594（Molecular Probes）
• Alexa Fluor 647（Invitrogen）
• Alexa Fluor 750（Molecular Probes）

Alexa Fluor 350

Coumarin B

Fluorescein

Alexa Fluor 555

Alexa Fluor 594

Alexa Fluor 647

Alexa Fluor 750

装置の測定設定

SpectraMax Mini フィルターキューブ構成

参考文献

1. ThermoFisher. Fluorescence SpectraViewer. https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/