Application Note QPix 400 システムを用いた蛍光バクテリアコロニーの選別
- 定量的な蛍光スクリーニングにより、ユニークなクローンを効率的かつ客観的に選別可能
- 多様な蛍光フィルターセットにより、実験の柔軟性が向上
- 使いやすいソフトウェアにより、定義された実験パラメーターに基づいて、毎回正確なコロニーをピックアップ可能
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はじめに
目的の遺伝子を組み込んだプラスミドを保持する大腸菌形質転換体のスクリーニングは、蛍光レポーター遺伝子を搭載したベクターの使用により、より簡便になりました。蛍光イメージングとスクリーニングは、タンパク質の折りたたみや分泌、酵素進化、タンパク質局在の研究において、個々のコロニーに関するユニークな情報を明らかにします。さらに、変異体のスクリーニングや形質転換マーカーの同定にも有効な直接的手法です。
従来の微生物コロニーの手動ピッキングは時間と労力を要します。QPix 400 システムは、1時間に3,000以上のコロニーをピックアップ可能であり、熟練技術者による手動ピッキング（1時間に約600コロニー）と比較して、少なくとも5倍の速度で、かつ98%以上の高精度でピッキングを行えます。蛍光イメージングモジュールを搭載した QPix 400 シリーズは、蛍光タンパク質の発現レベルに基づく表現型選別を可能にし、下流工程の時間を大幅に短縮します。幅広い蛍光クローンベクターに対応した複数の蛍光フィルターを備えた、業界を代表する微生物コロニーピッカーです。蛍光ベースの組換え体コロニースクリーニング法は、蛍光発現レベルを検出することで遺伝子融合産物の選別を可能にし、組換え体コロニーの選別における高いスクリーニング精度を実現します。
本テクニカルノートでは、モデル生物である**大腸菌（Escherichia coli）**を用いて、GFP（緑色蛍光タンパク質）またはCFP（シアン蛍光タンパク質）を発現する組換えプラスミドを保持する形質転換体の蛍光検出およびコロニー選別機能を QPix 400 シリーズで実演します。
材料と方法
アンピシリン耐性遺伝子と GFP 遺伝子を搭載した pFluoroGreen プラスミドを用いて、化学的に形質転換可能な大腸菌を形質転換しました。形質転換後の大腸菌は、アンピシリンを含む LB 培地に播種し、37℃で一晩培養しました。
カナマイシン耐性遺伝子と CYP 遺伝子を搭載した pCyanFP プラスミドを用いて、同様に大腸菌を形質転換しました。形質転換後の大腸菌は、カナマイシンと IPTG を含む LB 培地に播種し、37℃で一晩培養しました。pFluoroGreen プラスミドのベクターマップは図1A、pCyanFP プラスミドのベクターマップは図1Bに示されています。
図1. (A) アンピシリン耐性遺伝子および GFP 遺伝子を含む pFluoroGreen プラスミドのベクターマップ (B) カナマイシン耐性遺伝子および CYP 遺伝子を含む pCyanFP プラスミドのベクターマップ
白色光および蛍光イメージングによるコロニー選別
GFP を発現する大腸菌コロニーは、QPix 420 システムを用いて白色光（図2A）および蛍光（図2B）で撮像・スクリーニングされました。蛍光選別には、青色フィルターペア（励起/蛍光：457/536 nm）を使用しました。
QPix 400 シリーズによる白色光および蛍光イメージングは、目的の蛍光レポーター遺伝子を発現するコロニーの客観的な識別と選別を可能にします。画像取得後、QPix ソフトウェアがコロニーの特徴を解析し、培地上の位置を特定します。柔軟なソフトウェアにより、サイズ、密度、形態などの選別パラメーターを定義できます。定量的かつ調整可能な蛍光強度の閾値により、遺伝子やタンパク質の発現レベルを蛍光強度として記録できます。ユーザー定義の条件に基づいて選別されたコロニーは、96ピンの空圧式ピッキングヘッドにより高精度でピックアップされます。本実験では、内部平均蛍光強度（MFI）が40,000以上の GFP 発現コロニーを選別対象としました。選別条件に基づいて含まれたコロニー（図3A）および除外されたコロニー（図3B）が示されています。
同様に、CFP を発現する大腸菌コロニーも白色光（図2C）および蛍光（図2D）で撮像・選別されました。蛍光選別には同じ青色フィルターペア（457/536 nm）を使用し、MFI が20,000以上のコロニーを選別対象としました。選別されたコロニー（図3C）および除外されたコロニー（図3D）が表示されています。QPix ソフトウェアでは、蛍光選別条件を手動で調整できるため、バクテリアコロニーの客観的かつ定量的な事前スクリーニングにおいて、柔軟性と制御性が向上します。
図2. pFluoroGreen ベクターで形質転換されたすべての大腸菌コロニーが白色光下で検出され（A）、そのうち GFP 蛍光遺伝子を発現しているコロニーのみが蛍光チャネルで識別されました。（B）同様に、pCyanFP ベクターで形質転換されたすべてのコロニーは白色光下で検出され、（C）CFP 蛍光遺伝子を発現しているコロニーのみが蛍光チャネルで識別されました。（D）これらの結果は、GFP および CFP を用いた例により、複数の蛍光クローンベクターに対応可能な蛍光フィルターセットの柔軟性を示しています。
図3. ユーザー定義の選別条件に基づいて GFP（A）および CFP（C）蛍光チャネルで識別されたコロニーが黄色で表示されています。一方、選別条件を満たさない GFP 発現コロニー（B）および CFP 発現コロニー（D）は赤色で除外されており、全体の母集団から除外されたことが示されています。
まとめ
GFP や CFP などのレポーターを用いた蛍光スクリーニングは、従来のスクリーニング手法と比較して大きな利点があります。この効率的な技術は、タンパク質の折りたたみの追跡、in vitro におけるタンパク質分泌のモニタリング、酵素進化のためのライブラリ変異スクリーニングなど、さまざまな用途に活用できます。QPix 400 シリーズの蛍光機能を活用することで、組換え体コロニーのハイスループットスクリーニングと選別が容易になります。多様な蛍光レポーターに対応した蛍光フィルターセットが用意されており、シンプルなユーザーインターフェースにより、研究者は自身の生物学的目的に合わせて解析およびコロニー選別条件を柔軟に定義できます。QPix微生物コロニーピッカーシステムは、従来の手動手法に代わる高生産性かつ信頼性の高い選択肢を提供し、目的の組換えタンパク質発現コロニーの取得までの時間を大幅に短縮します。
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