Application Note QPix 400システムを用いた 蛍光細菌コロニーセレクション
- 定量的蛍光スクリーニングにより、ユニークなクローンを効率的かつ対物レンズで選択可能
- 多様な蛍光フィルターセットにより、実験の柔軟性が向上
- 使いやすいソフトウェアにより、定義された実験パラメーターに基づいて毎回正しいコロニーがピッキングされます。
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はじめに
目的の遺伝子を組み込んだプラスミドを保有する細菌の形質転換体のスクリーニングは、蛍光レポーター遺伝子を持つベクターの使用によって便利になった。蛍光イメージャーとスクリーニングは、タンパク質のフォールディングや分泌、酵素の進化、タンパク質の局在などを研究する際に、個々のコロニーに関するユニークな情報を明らかにする。さらに、突然変異のスクリーニングや形質転換マーカーを同定するための直接的な方法としても選ばれている。
微生物のコロニーを手作業でピッキングする従来の方法は、時間がかかり面倒です。微生物コロニーピッカーのQPix™ 400シリーズは1時間で3,000個以上のコロニーをピッキングできますが、熟練した技術者であれば1時間で600個のコロニーを手作業でピッキングできます。このように、時間がかかり、ミスが起こりやすい手動コロニーピッキングと比較して、自動コロニーピッキングは少なくとも5倍速く、ピッキング効率98%以上でより正確です。蛍光イメージャーモジュールを搭載したQPix 400シリーズは、蛍光タンパク質の発現レベルに基づくユニークなコロニーの表現型セレクションを可能にすることで、下流の処理時間を大幅に短縮します。幅広い蛍光クローニングベクターに対応する複数の蛍光フィルターを提供する、市場をリードする微生物コロニーピッカーです。蛍光ベースの組換えコロニースクリーニング法は、組換えコロニーを選択するためのより高いスクリーニング忠実度を提供する固有の蛍光発現レベルを検出することにより、遺伝子融合産物の選択を容易にする。
ここでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはシアン蛍光タンパク質（CFP）を発現する組換えプラスミドを保有するモデル生物である大腸菌を用いて、QPix 400 Seriesの蛍光ベースの検出およびコロニーセレクション機能を実証する。
材料と方法
アンピシリン耐性およびGFP遺伝子を有するpFluoroGreenプラスミドを用い、化学的にコンピテントな大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌培養液をアンピシリンを封じ込めたLB培地にプレーティングし、37度で一晩培養した。
カナマイシン耐性およびCYP遺伝子を有するpCyanFPプラスミドを用いて、化学的にコンピテントな大腸菌を形質転換した。形質転換した大腸菌培養物を、カナマイシンにIPTGを加えたLB培地を封じ込めたプレートにプレーティングし、37℃で一晩培養した。pFluroGreenプラスミドベクターマップを図1Aに、pCyanFPベクターマップを図1Bに示す。
Figure 1. (A) pFluoroGreen plasmid vector map with ampicillin resistance and GFP gene. (B) pCyanFP plasmid with kanamycin resistance and CYP gene.
白色光イメージングを利用したコロニーセレクション
GFP 形質転換細菌のコロニーを QPix™ 420 システムで白色光（図 2A）および蛍光（図 2B）イメージングし、スクリーニングした。GFP発現細菌の蛍光ベースの選択は、青フィルターペア（Ex/Emフィルター：457/536 nm）オプションを使用して行いました。
QPix 400シリーズで白色光と蛍光イメージャーを使用したコロニー検出により、対象蛍光レポーター遺伝子を発現するコロニーの対物レンズ同定とセレクションが可能になります。画像が取り込まれると、QPixソフトウェアが検出、特徴特性の解析、培養プレート上の個々のコロニーの位置の特定を行います。柔軟なソフトウェアにより、ユーザーはサイズ、コンパクトさ、形態などのコロニーセレクションパラメーターを定義できます。定量的で調整可能な蛍光強度しきい値は、蛍光強度として記録される遺伝子またはタンパク質の発現レベルを指定する。ユーザーが定義した基準に基づいてコロニーがセレクションされると、それらは高精度の完全空気圧式96ピンピッキングヘッドでピッキングされる。この実験では、内部の平均蛍光強度（MFI）値が40,000を超えるGFPを発現するコロニーが選択された。セレニーショ ン基準に基づいて選別されたコロニーを図3Aおよび図3Bに示す。
同様に、CFP発現細菌コロニーは、白色光（図2C）および青色フィルターペア（Ex/Emフィルター：457/536 nm）オプションを用いた蛍光イメージャー（図2D）を用いて同定・選択した。内部の平均蛍光強度値が20,000を超える蛍光コロニーが選択された。コロニーセレクション機能が表示され、ユーザー定義の基準に基づいて含まれるコロニー（図3C）または除外されるコロニー（図3D）が強調表示される。QPixソフトウェア内で蛍光セレクション基準を手動で調整できるため、ユーザーは対物レンズと定量的な細菌コロニーの事前スクリーニングにおいて、さらなる柔軟性と制御性を得ることができます。
図2. (A) pFluoroGreenベクターで形質転換された細菌コロニーはすべて白色光で検出される。(B）pFluoroGreenベクターで形質転換され、目的のGFP蛍光遺伝子を発現するコロニーのみが蛍光チャンネルで識別される。(C）pCyanFPベクターで形質転換されたすべての細菌コロニーが白色光で検出される。(D）pCyanFPベクターで形質転換され、目的のCFP蛍光遺伝子を発現するコロニーのみが蛍光チャンネルで同定される。これは、GFPとCFPで実証されたように、複数の蛍光クローニングベクターに適合する利用可能な蛍光フィルターセットの多用途性を示している。
図3. ユーザー定義のセレクション基準に基づいてGFP（A）およびCFP（C）蛍光チャンネルで同定されたコロニーは黄色でハイライトされている。ユーザー定義のセレクション基準を満たさないコロニーは、赤で示すように全集団から除外される（GFP発現；BおよびCFP発現；D）。
まとめ
GFPやCFPのようなレポーターを用いた蛍光スクリーニングは、従来のスクリーニング法に比べて大きな利点がある。この効率的な技術は、タンパク質フォールディングの追跡、in vitroでのタンパク質分泌のモニタリング、酵素進化のためのライブラリー変異スクリーニングなど、多くの応用の可能性がある。QPix 400シリーズの蛍光機能を利用すれば、組換えコロニーのハイスループットなスクリーニングとセレクションが簡単に行えます。さまざまな蛍光レポーターは、さまざまな蛍光フィルターセットでサポートされています。シンプルなユーザーインターフェースにより、研究者は独自の生物製剤に合わせた解析基準やコロニーセレクション基準をカスタマイズして定義することができます。このように、QPix 400シリーズの微生物コロニーピッキングシステムは、従来の手作業によるアプローチに代わる生産性と信頼性の高い代替手段を提供し、選択した組換えタンパク質発現コロニーを得るまでの時間を大幅に短縮します。
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