Application Note Fura-2 QBT カルシウムキット： 均質なFura-2カルシウム測定キット

はじめに

Fura-2色素は、細胞イメージング、GPCRを介した細胞内カルシウムフラックス、およびイオンチャネルの活性化におけるカルシウム動員を測定するための重要なツールと長い間考えられてきました。このレシオメトリック色素は、結合インジケーターと遊離インジケーターの蛍光強度比を計算することで、色素負荷や細胞プレーティングにおけるアッセイの不一致を補正するのに役立ちます。しかし、洗浄が必要なため、ウェル間のばらつきが大きくなり、各アッセイに時間と複雑さが加わります。

モレキュラーデバイスのFura-2 QBT™カルシウムキットは、実績のあるクエンチベースのテクノロジーとレシオメトリックFura-2カルシウムインジケータを組み込んでおり、検出前の細胞洗浄を省くことでスループットを向上させながら、細胞ベースのばらつきを最小限に抑える均質なアッセイをご提供します。さらに、Fura-2 QBT カルシウムキットは紫外スペクトルで励起するため、研究者は488 nmで励起する蛍光化合物を軽減することができます。

測定原理

Fura-2 AM は、340 nm と 380 nm で励起され、510 nm で発光するカルシウム感受性インジケーターです。カルシウムイオンと結合すると、色素は380 nmから340 nmへ吸収シフトを起こします。図1は、Fura-2に結合したカルシウムが増加すると、340/510 nmの発光シグナル（緑）が増加し、380/510 nmの発光シグナル（オレンジ）が減少することを示しています。発光シグナルの比（挿入プロット）は、濃度応答曲線の最大-最小シグナル応答を測定するために計算されます。

Fura-2 QBTカルシウムキットアッセイの調製

この研究では、Fura-2 QBT カルシウムキット、エクスプローラーフォーマット（PN #R8197）を使用しました。色素は20mM HEPESを含むHank's Balanced Salt Solution（HBSS）に再懸濁しました。Probenecid(PBX)を必要に応じて添加し、色素が細胞から漏出するのを抑制しました。前夜に384ウェル黒色および透明細胞プレートにプレーティングした接着CHO M1またはHeLa細胞をインキュベーターから取り出しました。25μLのアッセイバッファーまたは培地を含むウェルに、25μLのFura-2 QBT色素または競合キットの色素ローディングバッファーを添加しました。Fura-2 QBTキット（PN #R8197）またはBDレシオメトリックカルシウムキットを負荷したプレートを37℃、5% CO₂で1時間インキュベートしました。従来のFura-2洗浄プロトコール法も比較研究に使用しました。

従来のFura-2洗浄法を使用した場合、50μLの1X色素ローディングバッファーを添加する前に各ウェルから培地を除去し、他のキットと同じ時間と条件で細胞プレートをインキュベートしました。FlexStation®3  マルチモードプレートリーダーまたは FLIPR®Tetra システムで読み取る前に、全プレート をインキュベーターから取り出し、室温まで10分間冷却しました。従来のFura-2洗浄プロトコール法を用いたプレートは、読み取り前に余分な色素を除去するためにHBSSアッセイバッファーで3回洗浄する必要がありました。

FlexStation 3プレートリーダーおよびFLIPR Tetraシステムを用いた比カルシウム動員アッセイ

HBSS緩衝液＋20mM HEPESに5倍濃度の適切なリガンドを調製し、384ウェルポリプロピレンプレートに入れました。アゴニストはFlexStation 3 プレートリーダー（図2）またはFLIPR Tetra システム（図3）で検出中に、レシオメトリックアッセイに最適化されたパラメータを用いて添加しました。色素の励起は波長340 nmと380 nmで行いました。

510 nmでの発光シグナルが検出され、添加中と添加後を含めて約90秒間、各ウェルの両方の励起波長について相対蛍光単位（RFU）で測定されました。算出された出力は、アッセイ中の各時点における340 nmと380 nmの波長シグナルの比でした。レシオメトリックシグナルのトレースから、最大値-最小値を算出しました。グラフおよびEC₅₀/IC₅₀濃度のデータは、ScreenWorks®またはSoftMax®Proソフトウェアからエクスポートし、GraphPad Prismを用いて計算しました。Z factorの計算は、Zhangらによる方法を用いて行いました。

結果

***図2. Fura-2 QBT カルシウムキットは最大のシグナルウィンドウをご提供します。
このキットは、FlexStation 3プレートリーダーでEC₈₀またはIC₈₀において最大のシグナルウィンドウと最も堅牢なZ factorsを提供します。

***図3. Fura-2 QBTカルシウムキットアッセイは、アッセイのばらつきを取り除くのに役立ちます。
このキットは、より大きなシグナルウィンドウ、EC₈₀またはIC₈₀におけるロバストなZ factors、洗浄ステップを削除することによるアッセイのばらつきの除去を提供することにより、アッセイをさらに強化します。アッセイはUV LEDを備えたFLIPR Tetraシステムを用いて測定されました。

結論

Fura-2 QBT カルシウムキットは、モレキュラーデバイス独自のクエンチベースのテクノロジーを使用することにより、洗浄の必要性をなくし、従来のFura-2アッセイに代わる均質なアッセイをご提供します。これにより、スループットが向上し、不均一な細胞プレーティングや洗浄中の細胞ロスに関連するアッセイのばらつきが減少し、アッセイコスト（バッファーやばらつきによるアッセイリピートの必要性）が不要になります。BDレシオメトリックカルシウムキットや従来のFura-2 Washアッセイと比較して、Fura- 2 QBTカルシウムキットはEC₈₀およびIC₈₀において最大のシグナルウィンドウと最強のZ factorsをご提供します。Fura-2色素は紫外域で励起するため、このキットは488 nmで励起すると自家蛍光を発する化合物からの干渉を避けることができます。Fura-2 QBTカルシウムキットは、FlexStation 3 プレートリーダーおよびFLIPR Tetra システムでの使用が検証されており、ベンチトップアッセイから完全なハイスループットスクリーンまで、スケーラブルなソリューションをご提供します。

以下のモレキュラーデバイス システムと互換性があります。

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