Application Note GenePix アレイリスト（GAL）ファイルの作成

はじめに

ジャック・イェ・ツァイ博士
アクソン・インスツルメンツ、ユニオン・シティ、カリフォルニア州

最終更新日 最終更新日：2001年7月5日

マイクロアレイ技術の威力は、何千ものフィーチャーから同時に蛍光測定値を抽出できることである。各フィーチャーには、取得後の解析に意味のある正しいIDと名前が割り当てられていなければなりません。GenePix Array List (GAL)ファイルには、各ブロックのレイアウト、およびマイクロアレイのブロック内の各フィーチャーのIDに関する特定の情報が含まれている。

マイクロアレイの作製にはさまざまなアレイヤーが利用可能であり、それぞれが特定のプリントヘッド構成とプリントパラメーターを使用する。このような柔軟性のため、それぞれが独自のマルチウェルプレートファイルフォーマットを持つことができる。このため、GALファイルの作成が大幅に複雑になります。Axon Instruments社では、GenePix ProソフトウェアパッケージとともにArray List Generator（ALG）アプリケーションを提供しており、Stanfordスタイルの印刷手順を利用するアレイヤー用のGALファイルを作成することができます。アレイヤープラットフォームの柔軟性と多様性が増しているため、アレイリストは一般的にアレイヤープラットフォームのソフトウェアで作成することが望ましい。あるいは、GALファイルはMicrosoft Excelを使用して手動で作成することもできるし、場合によってはALGを使用することもできる。ALGはスタンフォード式アレイヤーの設定に基づいてGALファイルを生成するように設計されています。定義された印刷パラメーターとマルチウェルプレート情報ファイルを使用して、ALGは特定のマルチウェルプレート上の位置をマイクロアレイ上の特定のフィーチャーに変換します。デコンボリューションの結果は、マイクロアレイ上の各スポットについて、マルチウェルプレートの単一ウェルからの材料の起源を示すファイルである。このデコンボリューション処理には、アレイヤーの構成を十分に理解する必要がある。

アレイヤーにはいくつかの種類があるため、考えられるすべての状況を説明することは困難である。このアプリケーションノートでは、ALGを使用してStanfordタイプのアレイヤーの構成に基づいたアレイリストからどのようにGALファイルを作成できるかという具体的な例に焦点を当てます。このノートの最後に、ALGを使用せずにGALファイルを作成する方法について説明します。

方法と結果

スライドの印刷機能

ALGはプレーンテキストファイルまたはATFファイルをGALファイルに変換します。典型的なアレイヤーには、多数の印刷ピンを含む単一の印刷ヘッドがあります。1つの印字ヘッドは1つのピンを含むこともあれば、多数のピンを含むこともあります。スタンフォード型アレイヤーでは、これらのピンは例えば4×4のような正方形にレイアウトされます。

スタンフォード式」マイクロアレイファイル。例えば、アレイヤープリントヘッドのピン1から4に対応する1から4の番号のついた4つのブロックがある。アレイヤーの最初のパスで、各ブロックの同じ位置の左上にスポットができる。2回目のパスでは、前のスポットのすぐ右にスポットが印刷されます。あらかじめ定義されたブロック幅に達すると、次の行から印刷を開始する。これは、マルチウェルプレートの総数が処理されるまで続けられる。図1は、2×2アレイヤーが4つの10×10ブロックを印刷する場合のスポットの配置を示している。

ALG を使用した GAL ファイルの生成

プリントヘッドの設定と印刷パラメータに関する情報を提供したので、次にALGを使用してGALファイルを生成する手順を紹介する。

1. マルチウェルプレート入力ファイルの生成（図 2 参照）。
プレーンテキストのマルチウェルプレートファイル（アレイリスト）はExcelで作成します。ファイルにはRow、Column、IDの項目を封じ込めなければならない。各ファイルのカラムタイトルは、Row、Column、ID、Name、Plate（複数のプレートを記述したファイルの場合）の順である必要がありますが、NameとPlateフィールドは任意です。列タイトルがこれらと一致しない場合は、列タイトルをRow、Column、ID、Name、Plateに一致させるようプロンプトが表示されます。余分な情報列があってもよいが、ALGでは無視される。入力はタブで区切らなければならないので、入力ファイルは以下のような形式になる。

名前と ID には、タブ以外の任意の文字（スペース、カンマ、ピリオドなど）を封じ込められます。各ファイルには、各ブロックのすべての Feature-indicator について、Row、Column、ID のエントリを含める必要があります。

マイクロアレイは96ウェルプレートまたは384ウェルプレートからプリントできます。96ウェルプレートファイルでは12列8行です。384ウェルプレートファイルでは24列16行です。行と列は数値（例：行 3、列 2 の場合は 3,2）または英数字（例：C,2）で指定できます。ALGはマルチウェルプレートがウェルA1から最初にピッキングされるようにアレイヤーにセットされ、アレイヤーが行から列へ移動することを想定しています。

2. マルチウェルプレートテキストファイルを ALG に入力します。
エクセルで作成したプレーンテキストのマルチウェルプレートファイルは、図 3 に示すように ALG に入力する必要があります。

この例では、"Add "ボタンをチェックすることにより、4 つの 96-well プレートファイルが ALG に入れられます。Remove "ボタンをクリックすると、File Name リストからハイライトされたファイルがすべて削除されます。Remove All "ボタンをクリックすると、File Name リストからすべてのファイルが削除されます。ALG は、マルチウェルプレートファイルがリストに表示された順に ID と名前を割り当てます。

Up "または "Down "ボタンをクリックして、ハイライトされたファイルを File Name リスト内で移動します。

プレートファイル情報はダイアログボックスの下部に表示されます。

基本的な手順は384ウェルプレートと同じです。ALGのエントリーはすべて96ウェルプレートまたはすべて384ウェルプレートでなければなりません。

3. 4 枚の 96 ウエルプレートを 1 枚の 384 ウエルプレートに変換することは可能です。ALGには、4つの96ウェルプレートファイルから384ウェルプレートファイルを作成するWell Converterというユーティリティもあります。これは、4つの96ウェルプレートファイルから行と列の情報を取り出し、384ウェルプレートファイルの行と列の情報に変換します。入力ファイルはプレーンテキストまたはAxon Text Format (ATF)で、出力ファイルはATFです。ウェルコンバーターの出力ファイルはALGの入力ファイルとして使用されます。

4枚の96ウェル（12×8）プレートから384ウェル（24×16）プレートを作成する場合、8ピペットロボットまたは12ピペットロボットを使用できます。384ウェルプレートの作成に使用したピペットに応じて、8、12、96ヘッドを選択します。96ウェルプレートから384ウェルプレートへのサンプルのプレーティングは、通常このように行います：

A. A. 8ピペットロボットを使用する場合、96ウェルプレートからの2つのカラムが384ウェルプレート の1つのカラムにインターリーブされます；

B. B.12ピペットロボットを使用する場合、96穴プレートの2列が384穴プレートの1列にインターリーブされる；

C. 96ピペットロボットを使用する場合、2つの一般的なスポット順序がある：

i.) ジグザグ。4枚のプレートのスポッティング順序はそれぞれA1、A2、B1、B2である；

ii.） 時計回り：4枚のプレートのスポッティング順序はそれぞれA1、A2、B2、B1である（図4参照）。

4. "Block Properties "を設定する。
このリストで必要なパラメータは、マイクロアレイ上のフィーチャーの各ブロックがどのように印刷されたかを参照する。必要な測定値がわからない場合は、Feature Viewerに表示されるピクセル座標を使って計算することができます。ピクセルのサイズは走査分解能（例：5、10 µm）によって決定される。

A. 列数 各ブロックのフィーチャーの列数（各行のフィーチャーの数）を入力する。

B. 「列間隔(Column spacing) X 方向のフィーチャー間の距離をミクロン単位で入力する（すなわち、隣接するフィーチャー間の水平距離）。

C. 「行数(Number of rows)」： マルチウェルプレート入力ファイルのデータから計算されます。

D. 「Row spacing"（行間隔）： すなわち、隣接するフィーチャー間の垂直距離。

E. 「Feature diameter（フィーチャー直径）： 各フィーチャーの直径をミクロン単位で入力します。

F. F. 左上フィーチャーのx座標、すなわちスキャン画像の左端から左上フィーチャーの水平距離をミクロン単位で入力します。

G. 左上フィーチャーのy座標、すなわちスキャン画像の上端からの左上フィーチャーの垂直距離をミクロン単位で入力する。

5. プリントヘッド構成 "を選択します。
X、Yの先端間隔が9mmで、2x2フォーマットにレイアウトされた4つのピンを持つプリントヘッ ドを使用する場合、各ピンはフィーチャーの「ブロック」をプリントするために使用されます。したがって、"プレビュー "には4つのブロックがあります。Array List Generatorに入力されているパラメータから現在定義されているブロック構成のプレビュー画像が表示されます。

マルチウェルプレートファイルを正しい順序でインポートし、正しいスポッターサイズを選択したら、 Create Array File ボタンを選択して GAL ファイルを作成します。このボタンを押すとファイルダイアログボックスが開き、ファイル名と保存場所の入力を求められます。これにより、GenePix内でアレイリストとしてロードできる*.galファイルが作成されます。アレイリストには、アレイおよびブロックの寸法と、各特徴インジケータに関連付けられた名前が含まれています。インポートすると、これらの名前が Feature Viewer、Feature Pixel Plot ダイアログボックス、Results and Scatter Plot タブで使用され、画像上の個々のフィーチャーと各フィーチャーの名前および ID が関連付けられます。

GAL ファイルの手動生成
スタンフォード形式と異なるアレイヤーパラメータの場合、ALGを使用してGALファイルを生成することはできません。代わりに、GALファイルはMicrosoftのExcelのようなスプレッドシートで手動で作成する必要があります。GALファイルの2つの例を図5と図6に示す。

ExcelによるGALファイルの作成

GALファイルは、上記のATF（Axon Text File）形式にほぼ準拠しています。これらのファイルは、Microsoft ExcelでExcelスプレッドシートをテキスト（タブ区切り）として保存することにより作成される。GALファイルは、ヘッダーとデータレコードの2つのセクションで構成されています。ヘッダーにはブロックの構造および位置情報がすべて含まれており、データレコードには各スポットの名前と識別子の情報が含まれている。図5のGALファイルには4つのブロック（"BlockCount=4"）が記述されており、各ブロックは12列と2行で構成されている。簡単のため、最初の 15 フィーチャーのデータレコード情報（ID など）のみを記載した。

ヘッダー・セクションには、基本的なファイル情報と、名前とID（これはデータ・レコード・セクションにある）以外のすべてのブロック・プロパティが記述されている。各レコードの説明は以下の通り。

ATF 1.0

ATFファイルの最初の行は必須です。これはすべてのGALファイルで同じです： ファイル形式(ATF)とバージョン(1.0)。

7 5

ATFファイルの2行目も必須です。

7: オプションのヘッダーレコードの数で、データレコードのヘッダーを封じ込めた行の前に続く GAL ファイルの行数です。

5: データ列数。この例2では、後続行の数は13、データ列の数は5（Block、Row、Column、ID、Name）である。

タイプ=GenePix ArrayList V1.0

これはファイルのタイプであり、すべてのGALファイルで同じである。GenePixとArrayListの間のスペースは必須。

BlockCount

マイクロアレイのフィーチャーブロック数を決定し、この数を "BlockCount="フィールドと同じセルに入力する（例と同じ）。図5の例1では4である。

図 6 の例 2 では、GAL ファイルに 10 個のブロックがあるため、数値は 10 になります。

ブロックタイプ=0

0 = 長方形。

1 = オレンジ色のパッキング#1。

2 = オレンジ色のパッキング#2。

これらは例1と2で同じである。

ブロック(n)

Blockn="フィールドの後に、7つのブロックプロパティからなるヘッダ情報の残りを記入する。コンマとスペースで各番号を区切る。各ブロックには1つのレコードがあり、各レコードには7つのフィールドが封じ込められ ている。各フィールドはカンマとスペースで区切られる。

XOrigin 現在のブロックの左上フィーチャーの中心の X 位置。

現在のブロックの左上のフィーチャーの中心の X 位置 (µm 単位)。

YOrigin 現在のブロックの左上フィーチャーの中心の Y 位置 (µm 単位)。

FeatureDiameter カレントブロック内のフィーチャーの直径 (µm 単位)。

xFeatures 現在のブロック内のフィーチャーの列数。

xSpacing 現在のブロックの列間隔 (µm 単位)。

yFeatures 現在のブロック内のフィーチャーの行数。

ySpacing 現在のブロックの行間隔（μm単位）。

注：マイクロアレイ上の位置は、原点（マイクロアレイの左上隅）を基準としてミクロン単位で測定される。

データレコードの説明

Data Record セクションには、各フィーチャの詳細を記述するレコードが封じ込められる。フィーチャーのブロック番号、列番号、行番号、説明的な名前と識別子情報が含まれる。ヘッダーの最後の行である。各フィーチャに対して 1 つのレコードがあり、それぞれの記述欄のフィールドを含む：

*フィーチャーのブロック番号（必須）。

*行 *ブロック内の行位置（必須）。

*列 *ブロック内の列の位置（必須）。

*ID *各フィーチャーの固有識別子（必須）。

*Name *フィーチャーに表示される名前。

Block、Row、Column、IDは必須フィールドです。5つのフィールドはどのような順番でも構いません。

注：印刷物の ID がない場合、'empty' を ID として使用することができ、GenePix で GAL ファイルを開くとそのフィーチャーは存在しないフラグが立てられます。

各フィーチャーのブロック、列、行、ID、名前の 5 つのフィールドを含む 1 つのレコードで構成されるフィーチャー情報を入力します。ID は 16 文字まで、Name は 31 文字まで入力できます。各フィールドは、エクセルの別々のセルに入れる。

最後に、「テキスト（タブ区切り）（*.txt）」または「*.gal」として保存する。GenePixでファイルを開こうとする前に、Excelでファイルを閉じてください（ファイル共有の制約上、これは必要です）。GALファイルのフォーマットは上記のデモGALファイルのようになるはずです。

概要

ALGは、ユーザーが定義したブロック数、行間隔、列間隔、フィーチャインジケータ直径を持つブロックの配列を自動的に作成します。また、GALファイルで定義されたブロックの配列をプレビューします。GenePixソフトウェアのAnalyzeタブにあるLoad Array Listボタンは、スキャンしたマイクロアレイ画像ファイルにGALファイルの情報を適用します。さらに、GAL ファイルをインポートすると、Feature Viewer はフィーチャーにマウスを置くと、そのフィーチャーに関連する ID または名前を報告し、Analysis オペレーションではこれらの名前を他のすべての抽出データと一緒に Results タブにエクスポートします。Find 機能（"双眼鏡 "アイコン）は、GenePix 内の任意の場所から Name や ID を検索するために使用できます。

現在のALGユーティリティは、Stanfordタイプのアレイヤーの設定に基づいて設計されています。したがって、ALGを使用してGALファイルを作成できるのは、マイクロアレイがStanfordタイプのアレイヤーでプリントされた場合のみです。スタンフォード型以外のアレイヤーでALGを使用したい場合は、アレイヤー会社に連絡し、そのアレイヤーソフトウェアでGALファイル出力を提供するよう依頼することをお勧めします。

あるいは、Microsoft Excelのような表計算ソフトでGALファイルを手動で作成することもできます。テキストファイルのフォーマッ トは、上述のように非常に簡単であり、Axonのウェ ブサイトhttp://www.axon.com/GN_GenePix_File_Formats.html、GenePix File Formatsの項にも記載されている。

GALファイルを作成する際、注意しなければならないことがいくつかある。

1. プレーンテキストエディタはGALファイルの作成には使えない。Microsoft Excelを使用すること。

2. 2.書式は上記の通り正確に使用すること。

3. GALファイルのヘッダーセクションでは、GenePixとArrayListの間にスペースが必要です（例：Type=GenePix ArrayList V1.0）。そうでない場合、GenePix ソフトウェアはファイルを認識しません。

4. Name 欄に 40 文字を超える名前を入力することはできません。40文字を超える場合は、Name列の後に別の列を作り、説明やコメントなどの余分な文字を追加することができる。ただし、これらの説明やコメントは解析後の結果には表示されません。