Application Note MetaXpressおよびAcuityXpressソフトウェアとTransfluorアッセイシステムを用いた
GPCR活性化のハイコンテントスクリーニング

スーザン・カタラーノ博士（アキュメン・ファーマシューティカルズ）、シルヴィア・デ・ブルーイン、ジョー・ボスワース博士、ニール・グリックスマン博士、キンバリー・ベスト博士、ポーラ・リカート博士（モレキュラー・デバイセズ、1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089

はじめに

Gタンパク質共役型受容体（GPCR）は医薬品の標的として最も大きなクラスであり、その結果、GPCR受容体のアゴニストやアンタゴニストを検出するためのアッセイはスクリーニング業務において重要な役割を担っている。最近、Xsira Pharmaceuticals社は、GPCRの脱感作とリサイクリングを測定することによりGPCRの活性化をモニターする新規のハイコンテントアッセイであるTransfluor®アッセイを発表した。Transfluor Assayは現在、Molecular Devices社から独占的に入手可能である。

90以上の異なるGPCRで検証されたTransfluorアッセイは、事実上すべてのGPCRとGタンパク質のクラスを代表するすべてのGPCRに共通する、下流のGタンパク質シグナル伝達とは独立した共通の経路を使用します。このアッセイは、活性化後に目的の受容体と会合するGFPタグ付きβ-アレスチンの内在化を画像解析で定量する（図1参照）。

刺激されていないセルは、細胞質にβ-アレスチン-GFPの蛍光が散在している。過剰発現されたGPCRが活性化されると、β-アレスチンはレセプターを標的として内在化し、その結果、小さな蛍光を発するクラスリンコートピットが出現する。受容体がβアレスチンに対して高い親和性を持つ場合、セルはその後、ピットよりも大きく明るい蛍光エンドサイトーシス小胞を形成する。(Transfluor Assayは、GPCR活性化の下流で起こる生理学的事象の機能的測定法として、多くの医薬品創薬業務において、一次および二次スクリーニングとして広く採用されている（図2参照）。

MetaXpress®画像取得・解析ソフトウェアは、ImageXpress® 5000AおよびDiscovery-1™インストゥルメントを含むMolecular DevicesのすべてのハイコンテントスクリーニングシステムでTransfluorアッセイの画像取得と解析を完全に自動化します。オプションのアプリケーションモジュールは、一般的なハイコンテントアッセイのアッセイ特異性ターンキー解析を提供します。このアプリケーションノートで説明するTransfluorモジュールは、Transfluorアッセイからの画像を解析するために特異的に設計され、最適化されています。

MetaXpress®ソフトウェアは、画像、セルごとのセグメンテーション結果、アノテーションを管理するためのエンタープライズレベルのMDCStore™データベースと統合されています。AcuityXpress Cellular Informatics PlatformもMDCStoreデータベースとシームレスに統合されており、カーブフィット処理、アッセイクオリティの評価、ヒット、偽陽性、異常値、トレンドの同定のための強力なデータ可視化および統計ツールを提供します。MetaXpress®、AcuityXpress®ソフトウェアとTransfluor Assayを併用することで、スクリーニングの可能性を高め、GPCRモジュレーターを迅速に発見することができます。

Transfluor アッセイを使用するには、Molecular Devices 社でのみ入手可能なライセンスが必要です。ライセンスおよび入手可能なTransfluorアッセイ試薬の詳細については、最寄りの販売代理店にお問い合わせください。

カスタムセルバイセル解析

MetaXpress®画像解析ソフトウェアには、セグメンテーションパラメーターを簡単かつインタラクティブに最適化するために設計されたアッセイ特異性アプリケーションモジュールがオプションで含まれています。簡素化されたインターフェースにより、特定のアッセイに合わせた解析設定の簡単な設定とテストが可能です。(図3、パネルA参照）。

MetaXpress Transfluorモジュールは、特許取得済みのAdaptive Background Correctionシステムを使用して、ピット、小胞、核を周囲から区別するため、染色やタンパク質発現レベルにばらつきがあっても、選択的に測定・カウントすることができる。ピットの強度はバックグラウンドよりわずかに高いことがあり、GFPタグ付きβ-アレスチンの発現レベルはセルによって異なることがあるため、これは通常の閾値処理法では難しい。

Transfluorデータの細胞間解析用に設計されたTransfluorモジュールを使えば、ピットと小胞を同時に検出し、区別することができる。オプションの核検出は、データ正規化のための正確なセルカウントを提供します。画像解析には、ユーザーが調整可能な3つのパラメーターが利用されます。おおよその最小幅 "と "おおよその最大幅 "パラメーターは、ピット、小胞または核の予想されるサイズに応じて必要に応じて変更されます。Intensity above local background "パラメータは、各ピットまたは小胞をローカルバックグラウンドから最適に識別するために調整される。これにより、画像内のセル間で強度が異なる場合でも、実際のピットや小胞形成を識別し、正確に定量化する能力が大幅に向上します。

ピットまたは小胞の数、ピットまたは小胞に覆われた総面積、顆粒の平均および積分強度、核の面積および強度など、複数の測定値をデータベースに記録できます。結果はセルごとに提供されるほか、画像や部位ごとに要約されます。細胞結果の表の行をハイライトすると、対応するセルとオーバーレイが画像内で即座にハイライトされます。(図3のパネルBとCを参照）。

材料

Transfluor アッセイの実施には、Molecular Devices 社からのライセンスが必要です。Transfluor アッセイ試薬は、Molecular Devices 社から Transfluor ライセンシーに提供されます。詳細はMolecular Devices社にお問い合わせください。

注意：すべての溶液は、各実験の直前に新しく調製してください。

• β-アレスチン-GFPおよびβ2-アドレナリン受容体（β2AR）発現U2OS細胞（Molecular Devices社製）
• Corning Costar 384ウェルマイクロプレート (Cat. #3712)
• U2OS培地 10%熱不活性化FCS（Gibco Cat.#10082）、10 µg/mLゲンタマイシン（Gibco Cat.#15710）、10 mM HEPES（GibcoCat.#11344）、0.4 mg/mL Zeocin（GibcoCat.#R250）および0.4 mg/mL G418（GibcoCat.#10131）を添加したMEM（Gibco Cat.）
• アスコルビン酸培地： 5.7mMのアスコルビン酸溶液（L-アスコルビン酸ナトリウム、SIGMA Cat.
• イソプロテレノール原液 アスコルビン酸培地中の(-)-イソプロテレノール(+)-酒石酸塩の175 µMストック溶液（SIGMA Cat.
• プロプラノロール原液： (s)-(-)-プロプラノロール塩酸塩（SIGMA Cat.#P8688）の125 µM溶液、血清および抗生物質不含培地（10 mM HEPESを含むMEM）
• DPBS（SIGMA Cat.）
• 4%メタノールフリーホルムアルデヒド：16%メタノールフリーホルムアルデヒド（Polysciences Cat.
• DAPI、希釈液（Molecular Probes D-3571）

方法

アゴニスト用量反応アッセイ

ステップ1. 25μLのU2OS培地に4,500個/ウェルのセルをプレーティング。37℃、5% CO2で一晩培養する。

ステップ2. アスコルビン酸培地でイソプロテレノール原液の5倍連続希釈を10回行い、3.5倍イソプロテレノール用量反応溶液の11点系列を形成する。陰性対照としてアスコルビン酸培地のみを使用する。(表1参照）。

1. アゴニスト用量反応アッセイに必要なイソプロテレノール3.5倍溶液の濃度

ステップ3. 適切なイソプロテレノール3.5X用量反応溶液または陰性コントロールを各ウェルに10μLずつ加える。

ステップ4. 37℃、5% CO2で40～45分間（小胞形成剤）または30分間（ピット形成剤）インキュベートする。

アンタゴニスト用量阻害アッセイ

ステップ1. 23μLのU2OS培地に4,500個/ウェルのセルをプレーティングする。37℃、5% CO2で一晩培養する。

ステップ2. 175μMイソプロテレノールストックをアスコルビン酸培地で1:1000に希釈し、175nM 3.5Xイソプロテレノール刺激液を調製する。

ステップ 3. プロプラノロール原液をHepes入りMEMで10回5倍連続希釈し、一連の12.5倍プロプラノロール用量阻害溶液とする。陰性対照としてMEM/Hepesのみを用いる。(表2参照）。

2. アンタゴニスト用量阻害アッセイに必要なプロパノール12.5倍溶液の濃度

ステップ4. 各ウェルに適切な12.5Xプロプラノロール用量阻害溶液または陰性対照を2 µL加える。

ステップ5. 37℃、5% CO2で30分間インキュベートする。

ステップ6. 175nMイソプロテレノール刺激液またはアスコルビン酸培地（非刺激対照）を各ウェルに10μLずつ加える。

ステップ7. 37℃、5% CO2で40～45分間（小胞形成細胞）または30分間（ピット形成細胞）インキュベートする。

サンプルの固定と染色

ステップ1. 各ウェルに35µLの4%メタノールフリーホルムアルデヒドを添加してアッセイを停止する。蓋をし、室温で45分間インキュベートする。

ステップ 2. 各ウェルを50µLのDPBSで洗浄します。

ステップ3. 各ウェルに0.05mg/mL DAPIを8μLずつ添加する。室温で15分間インキュベートします。

ステップ4. 75 µL DPBSでウェルを2回洗浄し、75 µL DPBSに残します。

ステップ5. プレートをプレートシールで覆い、画像取得まで遮光して4℃で保存する。

画像取得

ステップ1. MetaXpress®ソフトウェアを使用し、DAPIおよびFITCフィルターセットと20x Plan FluorまたはPlan Fluor ELWD対物レンズを用いて、ImageXpress 5000AまたはDiscovery-1イメージングシステムでビンなし画像を取得する。ここに記載した結果は、1ウェルあたり2部位をイメージングしたものである。

画像解析

ステップ1. MetaXpress®ソフトウェアで、データベースから目的の画像を取り出し、Transfluor Assay Application Moduleで解析する。ピット/小胞染色と核染色の両方について、適切なソース画像、最小幅と最大幅、ローカルバックグラウンド以上の強度を選択する。

ステップ2. AcuityXpressソフトウェアで、プレートに適切な化合物と濃度を注釈します。

ステップ3. 目的のプレートを封入したデータセットを作成し、カーブフィット処理を行って各化合物のEC50値とIC50値を求めます。

アッセイ結果

β-アレスチン-GFPと野生型β2AR（ピット形成因子）またはenhanced β2AR（小胞形成因子）を発現するU2OSセルを、イソプロテレノール（アゴニスト）またはプロプラノロール（アンタゴニスト）で処理した。強化型β2ARは、β-アレスチンとの親和性を高めるためにC末端が修飾されており、その結果、蛍光小胞が形成された。

画像は上記のようにImageXpress 5000Aシステムで取得し、Transfluorアプリケーションモジュールで解析した。同様の結果がDiscovery-1システムでも得られた（データは示さず）。モジュールの精度を図4（ピット表現型）と図5（小胞表現型）に示す。この画像は、様々な濃度のアゴニスト・イソプロテレノールで刺激したセルについて、アルゴリズムがどちらの表現型でもピットと小胞を適切に同定していることを示している。刺激されていないセルは、最小限のピットや小胞を示す。

用量反応と用量阻害の解析

ピット形成細胞株と小胞形成細胞株の両方において、アゴニストであるイソプロテレノールの用量反応とアンタゴニストであるプロプラノロールの用量阻害を、MetaXpress®ソフトウェアTransfluorアプリケーションモジュールを用いて測定した。各用量は、6つの複製ウェルにわたって実行された。図6は、AcuityXpressソフトウェアによって作成されたプレートのヒートマップで、アッセイの用量依存的な反応を示している。

EC50およびIC50の計算では、プレート上のすべてのレプリケートウェルで平均した細胞あたりのピットまたは小胞面積を化合物濃度に対してプレーティングし、ヒルカーブフィット処理を行いました。AcuityXpressは、必要に応じて複数の化合物および複数のプレートを含むデータセット全体のカーブフィット処理を自動的に生成します（図7参照）。(表3は、2つの独立した実験から得られた両細胞株のアゴニストEC50とアンタゴニストIC50の要約である（図7参照）。これらの値は、イソプロテレノールによるβ2アドレナリン受容体の刺激（EC50=1-10 nM）、およびプロプラノロールによる拮抗作用（IC50=0.5-5 nM）に関する文献2の報告とよく一致している。

表3. β2-アドレナリン受容体刺激および阻害のEC50およびIC50の測定値

アッセイ統計的要約

アッセイ品質の指標であるZ'ファクターは、データのばらつきとシグナルのダイナミックレンジの両方を反映する。本実験で測定されたZ'ファクターは0.6以上であり、細胞ベースイメージングアッセイとして望ましい範囲内にある。

表4. アゴニスト刺激とアンタゴニスト阻害のZ'統計的要約

ディスカッション

MetaXpress®ソフトウェアTransfluorアプリケーションモジュールは、Transfluorアッセイにおいて、活性化GPCRへのβ-arrestinGFPトランスロケーションによって形成されるピットと小胞のセル同定と測定に成功した。野生型と高産生なβ2アドレナリン受容体を用いた独立した実験では、高いZ'ファクターで一貫したEC50とIC50値が得られた。これらの結果は、MetaXpress®ソフトウェアによって解析されたTransfluorアッセイが、GPCR活性化のための非常にロバスト性と再現性の高いアッセイであることを示している。

MetaXpress®ソフトウェアとAcuityXpress®ソフトウェアの迅速なデータ取得、解析、可視化機能は、Transfluor Assayの普遍性と相まって、GPCRモジュレーターのスクリーニングにユニークで強力なアプローチを提供する。

参考文献

1. Oakley, R.H., Hudson, C.C., Cruickshank, R.D., Meyers, D.M., Payne, R.E. Jr., Rhem, S.M., Loomis, C.R. 蛍光標識アレスチンの細胞内分布は、Gタンパク質共役型受容体をスクリーニングするための、ロバスト性、高感度、普遍的なアッセイ法を提供する。Assay Drug Devel Tech 2003;1:21-30.
2. Oakley、R.H.、Laporte、S.A.、Holt、J.A.、Barak、L.S.、Caron、M.G. クラスリンを介したエンドサイトーシスにおけるβ-アレスチンとGタンパク質共役型レセプターとの会合は、レセプターの再感作のプロフィールを規定する。J Biol Chem 1999;274:32248-32257.
3. Zhang、J.H.、Chung、T.D.、Oldenburg、K.R.ハイスループットスクリーニングアッセイの評価とバリデーションに使用する簡単な統計パラメータ。J Biomol Screen 1999;4:67-73.

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