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Application Note Gq共役型レセプターアッセイ:
FLEXstationシステムとFLIPRSシステムの比較

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はじめに

Gq共役型受容体の活性化は、シグナル伝達カスケードを介して細胞内コンパートメントから細胞質へのカルシウムイオンの流出を誘導する。カルシウム動員を介した細胞シグナリングは、細胞死、増殖、接着、運動性を含む広範な細胞機能に関与している。これらのプロセスが機能不全に陥ると、病気につながる可能性がある。そのため、Gq共役型受容体の機能は広く研究されており、これらのタンパク質はバイオテクノロジーや製薬会社にとって人気のある創薬ターゲットとなっている。

これらの研究で用いられた細胞株M1 CHOは、M1ムスカリン受容体を安定的にトランスフェクトしたものである。この膜貫通タンパク質はGq共役型アセチルコリン受容体である。これはカルバコールで刺激され、細胞質へのカルシウム放出を引き起こし、ピレンゼピンで阻害される。これらの知見は、カルバコールとピレンゼピンのEC50値とIC50値が、それぞれ2つの異なる蛍光マイクロプレートリーダー、FLEXstationシステムとFLIPRシステムで同様の範囲で得られることを示している。

1 Buck, M. A., and C. M. Fraser. 1990. Biochem. Biophys. Res. Commun. 173: 666-672.

FLEXstationは、アッセイ開発とfliprへの移植のためのフレキシブルなツールである

  • シンプルで迅速な実験セットアップ
  • 簡単なデータ解析
  • FLEXstationまたはFLIPRを使用することで、同等のEC50およびIC50値が得られる

方法

実験前夜、黒壁透明底96ウェルマイクロプレート(E&Kディストリビューター、cat# 655090)に30,000細胞/ウェルで100μlずつ細胞を播種した。翌日、細胞をFLIPR Calcium Assay Kitの1X Loading Bufferで30分インキュベートした。このバッファーには、M1 CHO細胞に存在する内因性排出ポンプを阻害するため、最終濃度2.5 mMのプロベネシドが封じ込められました。FLEXstationとFLIPRを用いて、細胞を封じ込めたマイクロプレートにアゴニストとアンタゴニストを分注し、細胞質へのカルシウムの動員をモニターした。

EC50値とIC50値の決定

活性化因子または阻害因子のHalf-log希釈液を用いた。特異性では、カルバコールは0~1μMの範囲をアゴニスト研究に用いた。アンタゴニスト研究では、まずセルをピレンゼピンの範囲(0~10μM)で合計2分間処理した後、0.5μMのカルバコール用量をマイクロプレートの全ウェルに添加した。

結果は、少なくとも2日間にわたって行われた少なくとも2つの独立した実験の代表的なものである。用量反応曲線(図5および6)の各ポイントは、8反復の平均値である。各レプリケート値は、アゴニストに対する最大応答と最小またはバックグラウン ドシグナルとの差(Max-Min)である。用量反応曲線のカーブフィットは4パラメータで、"C "値は最大反応の50%を引き起こす薬物濃度(EC50またはIC50値、図5と6参照)である。FLEXstationを用いたカルバコール のEC50値は12-30 nMであったが、FLIPRでは13-16 nMであった。ピレンゼピンの平均IC50値はFLEXstationで458 nM、FLIPRで523 nMであった。図1と図3のFLEXstationのデータは、それぞれ3点と4点の移動平均を用いて平滑化した。

まとめ

上述のように、カルバコールとピレンゼピンのEC50値とIC50値は、それぞれFLEXstationとFLIPRシステム間で一致していた。どちらの装置を用いても、セル調製と処理は同じであるため、FLEXstationでアッセイ法を開発し、スクリーニング目的でFLIPRにアッセイ法を簡単に移すことができます。その他の利点としては、SoftMax® Pro ソフトウェアにより、インストゥルメンテーションのセットアップとデータ解析が簡単に行えることが挙げられます。結論として、FLEXstationはアッセイ開発を促進する使いやすく多用途なツールです。

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