Application Note Gq共役型レセプターアッセイ：
FlexStationシステムとFLIPRシステムの比較
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はじめに
Gq共役型受容体の活性化は、シグナル伝達カスケードを介して細胞内コンパートメントから細胞質へのカルシウムイオンの流出を誘導します。カルシウム動員を介した細胞シグナリングは、細胞死、増殖、接着、運動性を含む広範な細胞機能に関与しています。これらのプロセスが機能不全に陥ると、病気につながる可能性があります。そのため、Gq共役型受容体の機能は広く研究されており、これらのタンパク質はバイオテクノロジーや製薬会社にとって人気のある創薬ターゲットとなっています。
これらの研究で用いられた細胞株M1 CHOは、M1ムスカリン受容体を安定的にトランスフェクトしたものです。この膜貫通タンパク質はGq共役型アセチルコリン受容体です。これはカルバコールで刺激され、細胞質へのカルシウム放出を引き起こし、ピレンゼピンで阻害されます。これらの知見は、カルバコールとピレンゼピンのEC50値とIC50値が、それぞれ2つの異なる蛍光マイクロプレートリーダー、FlexStationシステムとFLIPRシステムで同様の範囲で得られることを示しています。
1 Buck, M. A., and C. M. Fraser. 1990. Biochem. Biophys. Res. Commun. 173: 666-672.
FlexStationは、アッセイ開発とFLIPRへの移植のためのフレキシブルなツール
- シンプルで迅速な実験セットアップ
- 簡単なデータ解析
- FlexStationまたはFLIPRを使用することで、同等のEC50およびIC50値が得られる
方法
実験前夜、黒壁透明底96ウェルマイクロプレート（E&Kディストリビューター）に30,000細胞/ウェルで100μlずつ細胞を播種。翌日、細胞をFLIPR Calcium Assay Kitの1X Loading Bufferで30分インキュベートしました。このバッファーには、M1 CHO細胞に存在する内因性排出ポンプを阻害するため、最終濃度2.5 mMのプロベネシドが封じ込められました。FlexStationとFLIPRを用いて、細胞を封じ込めたマイクロプレートにアゴニストとアンタゴニストを分注し、細胞質へのカルシウムの動員をモニターしました。
EC50値とIC50値の決定
活性化因子または阻害因子のHalf-log希釈液を用いました。特異性では、カルバコールは0～1μMの範囲をアゴニスト研究に用いました。アンタゴニスト研究では、まずセルをピレンゼピンの範囲（0～10μM）で合計2分間処理した後、0.5μMのカルバコール用量をマイクロプレートの全ウェルに添加しました。
結果は、少なくとも2日間にわたって行われた少なくとも2つの独立した実験の代表的なものです。用量反応曲線（図5および6）の各ポイントは、8反復の平均値です。各レプリケート値は、アゴニストに対する最大応答と最小またはバックグラウン ドシグナルとの差（Max-Min）です。用量反応曲線のカーブフィットは4パラメータで、"C "値は最大反応の50％を引き起こす薬物濃度（EC50またはIC50値、図5と6参照）です。FlexStationを用いたカルバコールのEC50値は12-30 nMでしたが、FLIPRでは13-16 nMでした。ピレンゼピンの平均IC50値はFlexStationで458 nM、FLIPRで523 nM。図1と図3のFlexStationのデータは、それぞれ3点と4点の移動平均を用いて平滑化しました。
まとめ
上述のように、カルバコールとピレンゼピンのEC50値とIC50値は、それぞれFlexStationとFLIPRシステム間で一致していました。どちらの装置を用いても、セル調製と処理は同じであるため、FlexStationでアッセイ法を開発し、スクリーニング目的でFLIPRにアッセイ法を簡単に移すことができます。その他の利点としては、SoftMax® Pro ソフトウェアにより、インストゥルメンテーションのセットアップとデータ解析が簡単に行えることが挙げられます。結論として、FlexStationはアッセイ開発を促進する使いやすく多用途なツールです。
研究用のみ。診断には使用しないでください。
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