Application Note FlexStation システムを用いたGq共役型受容体アッセイ：
M1ムスカリン受容体

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はじめに

Gq共役型受容体は膜貫通タンパク質で、細胞外のシグナルを細胞内に伝達し、最終的に遺伝子発現を変化させる役割を担っています。Gq共役型受容体の中には、リガンドや薬剤がタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合することで活性化されるものがあります。この相互作用は、細胞内貯蔵小胞から細胞質へのカルシウムの動員などの下流事象を引き起こします。Gq共役型受容体の不適切な機能は、癌、神経変性疾患、心血管疾患に関与しています。従って、正常時と疾患時の受容体機能を比較することは重要です。

本研究で使用した細胞株M1 CHOは、M1ムスカリンGq結合受容体が安定的に導入されています *1。この受容体はカルバコールで刺激され、小胞体から細胞質へとカルシウムが放出されます。M1 Gq共役型受容体の活性化は、FlexStation® マイクロプレートリーダーとカルシウム感受性蛍光色素Fluo-3、またはモレキュラーデバイスのFlexStation Calcium Assay Kitを併用してモニターすることができます。その結果、カルバコールは両検出法で同程度の EC50値を示しました。

FlexStation システムは、アッセイ開発および基礎研究のための多用途機器です。

  • シンプルで迅速な実験セットアップとデータ解析
  • EC50およびIC50値の決定
  • Z´ factorが示すように、アッセイ開発に最適

方法

黒壁透明底96ウェルマイクロプレート（E&Kディストリビューター）の1ウェルあたり100 µLの容量に、1ウェルあたり30,000個の濃度で実験前夜に細胞を播種しました。FlexStation Calcium Assay Kit（モレキュラーデバイス）の1X Loading Bufferで30分インキュベートした後、FlexStationでカルバコール を分注し、細胞質へのカルシウム動員をモニターしました。すべての実験は、M1 CHO細胞に存在する内因性排出ポンプを阻害するため、最終濃度2.5 mMプロベネシドで行いました。

EC50値の決定

細胞は、アゴニストのHalf-log希釈液を用いて、カルバコール（0～1 µM）の範囲で曝露されました。結果は、少なくとも2日間にわたって行われた少なくとも4回の独立した実験の代表値です。ローデータは「最大-最小」および「絶対」RFU値として分析しました（図1、2）。C "値は最大反応の50％を引き起こす薬物濃度（EC50値、図3参照）です。4パラメータのカーブフィット処理を用いて、レプリケートサンプルの平均値をグラフにプロットしました。Fluo-3を用いたカルバコール のEC50値は19-39 nMの範囲でしたが、FlexStation Calcium Assay Kitでは12-30 nMでした（図3および4参照）。


Z´ factorの決定

マイクロプレートの半分の細胞を0.5 μM カルバコールで処理し、もう半分のプレートは1X Reagent Buffer（1X HBSS/20mM HEPES pH 7.4）で処理しました。FlexStation Calcium Assay Kitを用いて、カルバコールが介在するカルシウム動員をモニターしました（図5）。Z´ factorは式2を用いて計算しました：

σc-とσc+はそれぞれ陰性対照と陽性対照の標準偏差を示し、｜μc+ - μc-｜は陽性対照の平均値と陰性対照の平均値の差の絶対値を示します。FlexStation Calcium Assay Kitを用いてFlexStationで得られたZ´ factorは0.65でした。これは陰性対照と陽性対照の間に大きな分離帯があり、最適化された高品質のアッセイ法であることを示しています。

サマリー

FlexStationは、Gq共役型受容体の活性をモニター するためのカルシウム動員アッセイで再現性の高い結果を生み出します（図3）。第一に、カルバコールで得られたEC50値は、検出法、Fluo-3およびFlexStation Calcium Assay Kitの間で一貫していました。また、同じ日に分析したアッセイでは2倍以下の差しかなく、異なる日に分析したアッセイでは4倍以下の差しかなく、FlexStation システムの信頼できる性能がさらに実証されました（データは示さず）。最後に、Z´ factorの決定から、FlexStationが検討したモデル系に対するアッセイ開発のための優れたツールであることが示されました。さらに、機器のセットアップとデータ解析が簡単に行えるSoftMax® Proソフトウェアなどの利点もあります。さらに、デュアルモノクロメーターにより、アッセイ開発や基礎研究目的の柔軟性が向上します。結論として、FlexStationは基礎研究およびアッセイ開発ラボの目標達成を支援する、使いやすく多用途なツールをご提供します。

参考文献

  1. Buck, M. A., and C. M. Fraser. 1990. Biochem. Biophys. Res. Commun. 173: 666- 672.
  2. Zhang, J-H., T.D.Y. Thomas, and K. R. Oldenburg. 1999. J. Biomol. Screening 4: 67–73.


研究用のみです。診断には使用しないでください。

本書に使用されている商標は、モレキュラーデバイスまたはそれぞれの所有者に帰属します。


仕様は予告なく変更されることがあります。

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