Application Note マイクロ流体デバイスを用いた
3D神経ネットワークの高精度形態解析

はじめに

Oksana Sirenko｜Research Scientist｜モレキュラーデバイス
Karlijn Wilschut｜シニアサイエンティスト｜MIMETAS

神経疾患のメカニズム解明や標的薬剤の開発を進めるためには、生理学的に関連性の高いin vitroモデルの確立が極めて重要です。iPSC由来ニューロンは、化合物スクリーニングや疾患モデルとして大きな可能性を示していますが、近年で3D培養を用いたニューロンベースのアッセイ開発が有効なアプローチとして注目されています。3D培養は、組織構造や細胞の配置、細胞間および細胞－マトリックス間の相互作用など、ヒト組織の特徴をより忠実に再現する方法として広く認識されています *1 *2。

本研究の焦点は、マイクロ流体OrganoPlate®プラットフォームで培養されたiPSC由来ニューロンを用いて、高スループットな3D神経突起伸長アッセイを開発することにあり、神経変性疾患や神経毒性スクリーニングのための3Dモデルの確立を目的としています +3。OrganoPlate®は、最新の3D細胞培養技術、Phaseguides™、およびマイクロ流体技術を融合した高スループットプラットフォームです *4 *5 *6。OrganoPlateには96個のティッシュチップが搭載されており、ライブセルの長期培養に適しているほか、スクリーニング用途にも対応可能です。また、ImageXpress® Micro Confocalハイコンテントイメージングシステムのような標準的なラボ装置や自動化システムとの互換性も備えています。

利点

• iPSC由来ニューロンを用いた高スループット3D神経突起伸長アッセイの確立
• マイクロ流体OrganoPlate®プラットフォームを活用し、よりin vivoに近い結果を取得
• 神経ネットワークへの処理効果を評価するためのハイコンテントイメージングの最適化

材料

• OrganoPlate ® プラットフォーム（MIMETAS）
• ヒトiPSC由来iCell ®ニューロン（Cellular Dynamics International）
• ニューロン培地（セルラー・ダイナミクス・インターナショナル）
• マトリゲル（コーニング）
• カルセインAM（ライフテクノロジーズ）
• MitoTracker Orange（ライフテクノロジーズ）
• ヘキスト（ライフテクノロジーズ）
• サポニン（シグマ）
• PBS（シグマ）
• Αντι-β-チューブリンIII (TUJ-1) 抗体 (BD Biosciences)
• ImageXpress Micro Confocal ハイコンテントイメージングシステム（モレキュラーデバイス）
• MetaXpressHigh-Content画像取得および解析ソフトウェア、バージョン6.2（モレキュラーデバイス）

3Dマトリックス内での神経突起ネットワークの形成

細胞培養、化合物処理、細胞染色の各ステップは、マイクロ流体アッセイフォーマットを用いて実施されました。形態的な表現型およびニューロンの生存率を評価するために、共焦点イメージングおよび解析プロトコールが最適化されました。ヒトiPSC由来ニューロンは、Matrigelと事前に混合した後、OrganoPlate®において最終濃度\( 7\ \mathrm{mg}/\mathrm{mL} \)となるよう調整し、1チップあたり30,000細胞の密度で播種されました。Matrigel細胞懸濁液は播種中、氷上で保持されました。この懸濁液の播種量は、細胞密度およびMatrigel濃度に応じて1～1.4 µLの範囲で変動しました。播種後、プレートは組織培養用インキュベーター（37°C、5% CO₂）に30分間置かれ、Matrigelの重合を促進しました。その後、各チップのメディウムインレットおよびアウトレットに50 µLの培地を添加し、再びインキュベーターに戻しました。神経突起の伸長は播種後約24時間で形成され始め、培養中最大14日間にわたって伸長が継続しました。

OrganoPlateプラットフォームを神経毒性評価および神経発達研究に応用可能かどうかを検討するため、これらの神経培養系に対して神経突起伸長を阻害することが知られている複数の化合物を用いて処理を行いました *7。化合物処理は、播種後24時間のタイミングで実施されました。 培養は5日間にわたって化合物に曝露され、その間、化合物を含む培地は2日に1回交換されました。化合物の希釈は、最終濃度となるよう培地中で調製した後、OrganoPlateチップのメディウムインレットおよびアウトレットに添加することで行いました。

神経突起ネットワークの形成は、透過光イメージングを用いて時間経過とともにモニタリングされました。ニューロンの生存率を評価するために、以下の3種類の蛍光色素を用いたライブ染色が行われました：生存染色用のCalcein AM（1 µM）、ミトコンドリア膜電位染色用のMitoTracker Orange（1 µM）、および核染色用のHoechst（2 µM）。これらの色素混合液をチップに添加し、60分間インキュベートした後、培地に置換しました。また別の方法として、細胞を4%ホルムアルデヒドで固定し、PBS中の0.01%サポニン溶液で透過化した後、神経マーカーであるβ-チューブリンIII（TUJ-1）に対する蛍光標識一次抗体（1:100希釈）を用いて染色を行いました。核はHoechstで染色されました。固定細胞への一次抗体染色は、4°Cで一晩インキュベートして実施されました。

3D培養系における表現型解析

神経ネットワークへの処理効果を評価するために、ハイコンテントイメージングおよび解析が活用されました。本3Dマトリックス内でのニューロンの形態および生存率を評価するために、共焦点イメージングおよび解析プロトコールが最適化されました。画像取得には、ImageXpress® Micro Confocalシステムを使用し、10倍、20倍、または40倍の対物レンズで撮像を行いました。焦点軸（Z軸）に沿って複数の平面で画像を取得するZスタック撮像が行われ（図1）、3〜10 µm間隔で17〜30枚の画像を取得し、約150〜300 µmの深さをカバーしました。取得されたすべての画像は保存され、3D解析に加えて、2D投影画像（最大投影またはベストフォーカス）としても使用されました。

2Dにおける最大投影画像の解析

画像解析には、MetaXpress® ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアを使用しました。これらの画像に対する自動定量解析は、2つの方法で実施されました：2Dの投影画像を用いた解析、またはZスタックを用いた3D画像解析です。投影画像の解析では、Zスタック画像を取得時に2Dの最大投影画像に変換し、その後、MetaXpressのNeurite Outgrowthアプリケーションモジュールを用いて解析を行いました。表現型の評価項目には、神経ネットワークの広がりや複雑性の定量的特徴づけが含まれ、評価指標としては、神経突起の総伸長量、分岐数、突起数、細胞数および生存率などが用いられました。透過光画像の解析には、ベストフォーカス投影画像が使用されました。投影画像を用いた解析は迅速でありながら、神経ネットワークの広がりを正確に推定することが可能です。ただし、2D解析には限界があり、体積情報の算出ができず、通常は対象物の一部しかカウントされないという制約があります。図2および図3には、コントロール群およびロテノン処理群の神経培養における蛍光合成画像と、神経突起伸長を測定するために使用された「解析マスク」が示されています。得られた測定値には、神経突起の総伸長量、分岐数、突起数、細胞数（細胞体数）が含まれます。図4では、トリフェニルリン酸、テトラエチルチウラム、ヘキサクロロフェン、ロテノン、メチル水銀（各10 µM）といった神経毒性化合物への曝露により、神経突起の長さ、分岐数、および細胞生存率が低下した様子が示されています。

3D可視化および3D画像解析

MetaXpressソフトウェアには、隣接するZプレーン間のオブジェクトを統合し、細胞やネットワークの3D可視化を可能にする3D解析オプションが搭載されています。画像は、カスタムモジュールを用いた3D解析で処理され、「find fibers」機能を使用して神経突起伸長を定量化するための“fiber”測定値が生成されました。また、細胞核のカウントも行われました。

まず、各Zプレーンでオブジェクトを検出し、「connect by best match」機能を用いて3D空間内で接続します。3D解析は一般に処理負荷が高いものの、3D空間内のオブジェクト（重なり合う複数の構造を含む）に対して、より高い解像度と定量精度を提供します。3D解析から得られた測定項目には、神経突起（fiber）の数、細胞体積、突起の総体積、突起数、分岐点数などが含まれます。細胞数（核数）は、Hoechst染色陽性の「球状オブジェクト」を検出することで定義されました。図5Aには、“fiber”および“nuclei”の解析マスクが示されています。

別のカスタムモジュールでは、**細胞生存率（Calcein AM陽性の細胞体）およびミトコンドリアの健全性（MitoTracker Orange陽性の細胞体）**の評価が行われました。3Dでのセルスコアリング解析により、生細胞（Calcein AM陽性）およびミトコンドリアが健全な細胞（MitoTracker陽性）のカウントと特徴づけが可能となりました。この解析法により得られた結果には、細胞数（核数）、生細胞数（Calcein AM陽性）、MitoTracker陽性細胞数、細胞体積、蛍光強度などが含まれます。図5Bおよび図5Cには、「Calcein AM陽性細胞質」「MitoTracker陽性細胞質」「核」の解析マスクが示されています。図6では、神経突起ネットワークに対する化合物の影響を特徴づける複数の測定結果が示されており、突起数（“fiber”）や分岐点数、生細胞数、ミトコンドリアが健全な細胞数の減少が確認されています。

OrganoPlatesを用いた3D神経毒性アッセイ

表現型のリードアウトには、マルチプレックス測定による神経ネットワークの広がりと複雑性の3D定量評価が含まれます。この神経モデルシステムでは、アッセイの再現性を評価し、複数の測定項目を特徴づけ、既知の神経毒性化合物をいくつか検証しました。これらの解析手法を通じて、神経突起ネットワークの複雑性に対する化合物の濃度依存的な阻害効果を正確に測定することができました。したがって、本手法は神経毒性予測のためのハイスループット・ハイコンテントな化合物スクリーニングに利用可能です。

結論

MIMETAS OrganoPlates®を用いた3D神経培養に対する処理効果の定量的コンフォーカル・ハイコンテントイメージング手法の開発 本手法では、MIMETAS OrganoPlates®を用いた3D神経培養において、細胞の生存率および形態に対する処理効果をハイスループットで表現型評価することが可能です。コンフォーカルイメージングと多変量3D解析により、神経突起のカウントおよび特徴づけが可能であり、神経突起の伸長や分岐の統計的評価も3D空間で行えます。これらの解析手法により、神経ネットワークの特徴づけが可能となり、EC₅₀値の算出や選択した化合物の毒性効果の比較に使用できる定量的な測定結果が得られます。

参考文献

1. Chang, TT; Hughes-Fulford, M (2008). Monolayer and Spheroid Culture of Human Liver Hepatocellular Carcinoma Cell Line Cells Demonstrate Distinct Global Gene Expression Patterns and Functional Phenotypes. Tissue Eng Part A. 15(3): 559-567
2. Kunz-Schughart, LA et al. (2004). The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol. Screen. 9(4): 273-285
3. Trietsch, SJ et al. (2013). Microfluidic titer plate for stratified 3D cell culture. Lab Chip. 13: 3548-3554
4. Van Duinen, V et al. (2015). Microfluidic 3D cell culture: from tools to tissue models. Curr. Opin. Biotechnol. 35: 118-26
5. Sirenko, O et al. (2014). High-Content HighThroughput Assays for Characterizing the Viability and Morphology of Human iPSCDerived Neuronal Cultures. Assay and Drug Dev. Technologies.12(9-10): 536-47
6. Vulto, P et al. (2011). Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab Chip. 11: 1596-1602
7. Wevers, NR et al. (2016). High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Sci. Rep. 6: 38856

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