Application Note セルペインティングアッセイを用いた
ハイコンテント表現型プロファイリング

はじめに

アンジェリン・リム博士｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
クリストファー・ニシオカ｜フィールドアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
ミーシャ・バシュクロフ｜プロダクト・オーナー｜モレキュラー・デバイス

ハイコンテント表現型プロファイルは、遺伝子機能研究、創薬、毒性学などの研究分野でますます普及しています。このアプローチの長所は、シングルセルの解像度で捉えられる偏りのない多次元情報にあり、これにより個々の細胞の状態を解析し、プロファイリングし、集団レベルのデータと比較することが可能になります。このプロファイリングアプローチは、一般的な表現型スクリーニングとは対照的で、事前にいくつかのパラメーターだけが選択されます。その結果、従来の表現型スクリーニングでは、実験的処理によって引き起こされる生物製剤の変化のほとんどが無視されがちです。

細胞の表現型プロファイルは、細胞の状態から得られる数百から数千の定量可能な特徴から構成されます。これらの特徴には、バイオマーカーの 発現、テクスチャー、分布から抽出された情報が含まれます。多くの場合、これらのマーカーはオルガネラに特異的な仕様であり、オルガネラの構造、空間的組織、他の細胞内構造との関係に関する情報を与えます。すべてのセルからの情報を取り揃えることで、化学物質、低分子、遺伝的摂動の影響を研究する際に、偏りのないアプローチが可能になります。類似した作用機序（MOA）を持つ化合物は、しばしば細胞形態に類似した変化をもたらします。同様に、同じ経路における遺伝的摂動は、類似した表現型プロファイルをもたらすことが多く、表現型プロファイリングがハイスループット機能ゲノム研究に利用できることを示唆しています7。

表現型プロファイリングでよく用いられるセルペインティングアッセイは、最大6種類の蛍光色素を用いて、様々な細胞内構造を単一細胞レベルで標識・可視化します。このアッセイの目的は、細胞状態の代表的なイメージを構築するために、細胞の可能な限り多くを可視化することです。セルペインティングアッセイ用の標準色素セットは、核、小胞体、アクチン、ゴルジ装置、RNA（および核小体）、およびミトコンドリアを標識します。適切なフィルターセットを装備したハイコンテントイメージャーシステムを用いて、蛍光標識細胞の画像を迅速に取得します。続いて自動画像解析が行われ、特異的な細胞の特徴が同定、抽出、測定されます。得られた一連の測定値は表現型プロファイルを構成し、これをさらに解析してヒットピッキングやクラスタリング解析に用いることができます（図1）。

ここでは、Gustafsdottirら3によるCell Paintingプロトコルに基づいたハイコンテント表現型プロファイルのワークフローを示します。画像セグメンテーションと計測はIN Carta™画像解析ソフトウェアで行い、データ解析はHC StratoMiner™で行います。IN Carta™ソフトウェアでは、画像解析ルーチンを調整することで、細胞や細胞小器官のロバスト性検出が可能です。ディープラーニングによるセマンティックセグメンテーションモジュール（SINAP）は、困難な特徴の検出を改善するために使用できます。核やセルの検出には、事前にトレーニングされたディープラーニングモデルが利用できます。さらに、ユーザーは独自のデータセットを用いて、特異性対象オブジェクトに基づいた独自のモデルをトレーニングすることができます。HC StratoMineRは、大規模な多次元データセットを処理するために開発されたウェブベースのツールです。このプラットフォームは、ハイコンテントデータ解析のためのガイド付きステップバイステップワークフローを特徴としています。HC StratoMinerは、ウェブブラウザからアクセス可能なウェブベースツールとして機能するため、ユーザーは、大規模データセットを処理するためにしばしば必要とされる追加の計算資源を必要としません。このワークフローを用いると、同じ化合物で処理したセルが類似した表現型プロファイルを示すことがわかりました。階層クラスタリング解析では、パクリタキセルやロテノンのような毒性の高い化合物がグループ化されました。オートファジーに影響を与えるクロロキンやテトランドリン2,4も同じクラスタリングで見つかりました。これらの結果は、提案したワークフローが、ハイコンテント表現型プロファイルを実行するためのユーザーフレンドリーでロバスト性の高いアプローチであることを示しています。

方法

セル培養

U2OS細胞株（ATCC）は、製造元の推奨に従って継代・維持しました。セルペインティングアッセイはBrayら1. 簡単に述べると、U2OS細胞を、合計40μLのマッコイ培地（10％FBS添加）中で、1ウェル当たり2000細胞でGreiner 384ウェルμクリアプレートに播種しました。化合物処理の前に、セルを37℃で24時間インキュベートしました。

培養液は、播種24時間後、化合物を添加する前に2％（vol/vol）FBS入りのマッコイ培地に交換しました。ここでは以下の11種類の化合物を用いました： Ca-074-Me、CCCP、クロロキン（エンゾ）、サイトカラシンD、エトポシド（カルビオケム）、ラトルンクリンB、ラパマイシン（シグマ）、ロテノン（エンゾ）、スタウロスポリン、パクリタキセル、およびテトランドリン（指示がない限り、すべての化合物はSeleckChemから購入しました）。化合物は7点、1:3希釈系列で4重ウェルで試験しました。DMSOコントロール、陰性コントロール、陽性コントロールも同じプレートに含まれました。細胞を化合物とともに24時間インキュベートしました。

染色

生細胞をMitoTracker DeepRed（500 nM）で37℃、暗所で30分間染色した後、PFA（3.2%vol/vol）で20分間固定しました。セルは洗浄後、トリトン-100（0.1%）で20分間室温で透過処理しました。染色液は以下の濃度で調製しました： 5μL/mLのファロイジン、100μg/mLのコンカナバリンA、5μg/mLのヘキスト、1.5μg/mLのWGA、3μMのSYTO 14色素をブロッキング液（1X HBSSおよび1% wt/vol BSA）中に溶解しました。セルを洗浄し、染色液とともに室温で30分間インキュベートしました。染色液を除去し、セルを3回洗浄した後、粘着ホイルで密封しました。全ての洗浄ステップを1X HBSSで行いました。

画像取得

画像は、ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System（Molecular Devices）を用いて、20X Plan Apo対物レンズ、共焦点ピンホールサイズ60 μmで取得しました。以下のフィルターを使用しました（ex/em）： DAPI 377/447、FITC 475/536、TRITC 543/593、TexasRed 560/624、Cy5 631/692。ウェルあたり4視野を撮像しました。画像フォーカスを損なう可能性のあるプレー トの平坦性の問題を考慮し、Best focus projection オプションを使用して 3 枚の小さな Z スタック画像を取得しました。

特徴抽出

画像解析はIN Cartaソフトウェアを用いて行いました。画像セグメンテーションプロトコルは以下のように設定しました： Hoechst染色した核を、カスタムセグメンテーション（事前に学習させたNucleiモデル）を用いてプライマリーターゲットとしてセグメンテーションしました。エッジに触れる対物レンズは除外しました。ロバスト性オプションを使用して、TRITCチャンネル内のセルをセグメンテーションしました。さらに、3つのオルガネラクラスを指定されたオプションでセグメンテーションしました： ミトコンドリア（ネットワーク）、アクチン（線維）、小胞体（ネットワーク）。セルあたり合計280の測定値が出力として選択されました。

データ分析

特徴抽出終了後、セルレベルのデータをcsv形式にエクスポートし、化合物情報を含むメタデータを含むテキストファイルとともにHC StratomineR（CoreLife Analytics）にアップロードしました。プレートマップは、StratomineRのインターフェイス内で定義されました。Quality Controlタブを使用して、異常値ウェルは解析から除外されました（50セル未満のウェルは除外されました）。データ形質転換は、推奨される方法で行い、フィーチャースケーリングを行いました。主成分分析（PCA）はデータ削減のために使用されました。その結果得られた15成分を用いて距離スコアを算出しました。距離スコアは、ウェル内のセルに対する処理の表現型効果の尺度として定義されます6。 距離スコアはその後、ヒット選択と階層クラスタリングに使用できます。

結果

細胞は11種類の化合物で処理され、そのうちのいくつかは、以前のセルペインティング研究で参照化合物として使用されたものです5。化合物処理後、細胞をミトコンドリア、アクチン、ゴルジ装置、核小体（RNA粒子）、小胞体（ER）、核について染色しました（図2）。

IN Carta™ソフトウェアを用いて、検出された各細胞から様々な細胞の特徴をすべて抽出しました。このソフトウェアは、A. 直感的なユーザーインターフェース B. 強度、テクスチャー、形状、空間調整（オルガネラ間の空間関係など）、共局在化など、表現型プロファイルに重要な測定値を提供 C. 不偏的な特徴セグメンテーションを可能にするディープラーニングセマンティックセグメンテーションモジュール（SINAP）によるロバスト性特徴同定を備えています。これらのモデルは、ユーザー特有の対象オブジェクトに基づく画像でさらに学習させることができます。

SINAPモジュールは、核同定を改善するために解析プロトコルで使用されました（図3）。内蔵核モデルは1000以上の画像でトレーニングされました。トレーニングセットには、異なる倍率で、異なる色素（DAPI、Hoechst、Hematoxylin/Eosin）で染色されたイメージングモダリティ（蛍光イメージャーと明視野）を用いて取得された核が含まれており、したがって、多種多様な画像での使用に適しています。画像解析のセットアップ中に、核モデルが核の検出を向上させ、接触している核を正確に分割できることが観察されました。SYTO14染色は、「ロバスト性」セグメンテーション法を使用して細胞質を定義するために使用されました。ER、ミトコンドリア、アクチンもセグメンテーションされ、解析されました。さらに、細胞全体、核、細胞質の両方で、全チャンネルから全体的な強度測定が行われました。

分析されたフィーチャーは、IN™ソフトウェア内で簡単に確認することができます。ヒートマップ表示やヒストグラムなどのオプションは、一般的なデータ探索に利用できます。セル単位やサマリーデータはcsvファイルとしてエクスポートでき、下流のデータマイニングや解析に利用できます（図4）。

データ分析

IN™ソフトウェアから得られた測定値はエクスポートされ、さらなるデータ解析のためにHC StratoMinerにアップロードされました。ここでは、HC StratoMineR（ウェブベースのハイコンテントデータセットツール）を使用しました。その使いやすさの理由は、ガイド付きプラットフォームにより、データ解析の専門家でなくてもデータ解析ワークフローをナビゲートできることです。さらに、HC StratoMineRはウェブベースのツールであるため、エンドユーザーが大規模で複雑なデータセットの分析に必要な追加の計算リソースを設定・セットアップする必要がありません。

主成分分析（一般化重み付き最小二乗法）を用いて、280の測定値を15の成分に分類しました。その後、階層的クラスタリングが行われ、各要素間の関係がデンドグラムで表わされました（図5）。同じ化合物で処理されたセルはクラスタリングされる傾向があります。例えば、クラスタリング9はスタウロスポリンで処理したセルだけから構成されています。同様の細胞効果を持つことが知られている化合物もまた、クラスタリングされました。アクチン重合阻害剤であるサイトカラシンDとラトルンクリンBはクラスタ6に見られました。オートファジー経路に影響を及ぼすことが知られているテトランドリンとクロロキンもまた、一緒にクラスタリングされました（クラスタリング5）。これらの結果は、提案されたワークフローが、ハイコンテント表現型プロファイルを実行するための、実現可能で、実行しやすいアプローチであることを示しています。

結論

• ImageXpress マイクロコンフォーカルシステムは、ハイコンテント、セルペインティングアッセイのイメージングに適しています。
• IN Carta™ソフトウェアは、使いやすさと高度なフィーチャーセグメンテーションオプション（SINAP）を兼ね備えており、ロバスト性かつ偏りのない細胞フィーチャーの同定を容易にします。
• StratoMineRプラットフォームは、直感的なガイド付きワークフローにより、熟練者でなくても表現型データ解析を迅速に行うことができます。
• 全体的な結果から、ImageXpress® Micro Confocalシステム、IN™ソフトウェア、StratoMineRを用いた画像ベースプロファイリングアッセイの実現可能性が示されました。

参考文献

1. Bray MA, Singh S, Han H, Davis CT, Borgeson B, Hartland C, Kost-Alimova M, Gustafsdottir SM, Gibson CC, Carpenter AE. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 2016 Sep;11(9):1757-74. doi: 10.1038/ nprot.2016.105. Epub 2016 Aug 25. PMID: 27560178; PMCID: PMC5223290.
2. Gong K, Chen C, Zhan Y, Chen Y, Huang Z, Li W. オートファジー関連遺伝子7（ATG7）と活性酸素種／細胞外シグナル制御キナーゼは、ヒト肝細胞癌におけるテトランドリン誘導オートファジーを制御する。J Biol Chem. 2012 Oct 12;287(42):35576-88. doi: 10.1074/jbc.M112.370585. Epub 2012 Aug 27. pmid: 22927446; pmcid: pmc3471698.
3. Gustafsdottir SM, Ljosa V, Sokolnicki KL, Anthony Wilson J, Walpita D, Kemp MM, Petri Seiler K, Carrel HA, Golub TR, Schreiber SL, Clemons PA, Carpenter AE, Shamji AF. 多様な細胞状態を測定するマルチプレックス細胞プロファイリングアッセイ。PLoS One. 2013 Dec 2;8(12):e80999. doi: 10.1371/journal. pmid: 24312513; pmcid: pmc3847047.
4. Mauthe M, Orhon I, Rocchi C, Zhou X, Luhr M, Hijlkema KJ, Coppes RP, Engedal N, Mari M, Reggiori F. Chloroquine inhibits autophagic flux by decreasing autophagosomelysosome fusion. Autophagy. 2018;14(8):1435-1455. doi: 10.1080/15548627.2018.1474314. Epub 2018 Jul 20. PMID: 29940786; PMCID: PMC6103682.
5. Nyffeler J, Willis C, Lougee R, Richard A, Paul-Friedman K, Harrill JA. 画像ベースのハイスループット表現型プロファイルを用いた環境化学物質の生物活性スクリーニング。*Toxicol Appl Pharmacol.*2020 Jan 15;389:114876. doi: 10.1016/j.taap.2019.114876. Epub 2019 Dec 30. pmid: 31899216.
6. Omta WA, van Heesbeen RG, Pagliero RJ, van der Velden LM, Lelieveld D, Nellen M, Kramer M, Yeong M, Saeidi AM, Medema RH, Spruit M, Brinkkemper S, Klumperman J, Egan DA. HC StratoMineR：ハイコンテントデータセットの迅速解析のためのウェブベースツール。Assay Drug Dev Technol. 2016 Oct;14(8):439-452. doi: 10.1089/adt.2016.726. Epub 2016 Sep 16. pmid: 27636821.
7. Rohban MH, Singh S, Wu X, Berthet JB, Bray MA, Shrestha Y, Varelas X, Boehm JS, Carpenter AE. セルペインティングによるヒト遺伝子および対立遺伝子機能の系統的形態学的プロファイリング。Elife. 2017 Mar 18;6:e24060. doi: 10.7554/ eLife.24060. pmid: 28315521; pmcid: pmc5386591.