Application Note セルペイントアッセイを用いた
ハイコンテント表現型プロファイリング

Angeline Lim博士｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Christopher Nishioka｜フィールドアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Misha Bashkurov｜プロダクト・オーナー｜モレキュラーデバイス

はじめに

ハイコンテント表現型プロファイリングは、遺伝子機能解析、創薬、毒性評価など、幅広い研究分野でますます注目を集めています。このアプローチの強みは、シングルセルレベルで取得されるバイアスのない多次元情報にあり、個々の細胞状態を解析・プロファイリングし、集団レベルのデータと比較することが可能です。このプロファイリング手法は、関心のある経路に関連するパラメーターのみを事前に選択する従来の表現型スクリーニングとは対照的です *1。その結果、従来のスクリーニングでは、実験処理によって生じる生物学的に重要な変化の多くが見落とされる傾向があります。

細胞の表現型プロファイルは、細胞状態に由来する数百から数千の定量可能な特徴で構成されます。これらの特徴には、バイオマーカーの発現、テクスチャ、分布などの情報が含まれます。多くの場合、これらのマーカーは細胞小器官に特異的であり、その構造、空間的配置、他の細胞内構造との関係に関する情報を提供します。すべての細胞から得られる情報の集合により、化学物質、低分子化合物、遺伝子改変の影響をバイアスなく研究することが可能になります。作用機序（MOA）が類似する化合物は、細胞形態に類似した変化をもたらすことが多いため、表現型プロファイルの比較により、新規化合物のMOAに関する洞察が得られる可能性があります *3。同様に、同一経路に関与する遺伝子改変は、類似した表現型プロファイルを示すことが多く、表現型プロファイリングはハイスループット機能ゲノミクス研究にも活用できることが示唆されています *7。

表現型プロファイリングで広く用いられているセルペイントアッセイでは、最大6種類の蛍光色素を使用して、シングルセルレベルで多様な細胞内構造を可視化します。このアッセイの目的は、細胞の状態を代表する画像を構築するために、可能な限り多くの細胞構造を可視化することです。セルペイントアッセイの標準的な色素セットでは、核、小胞体、アクチン、ゴルジ体、RNA（および核小体）、ミトコンドリアが標識されます。適切なフィルターセットを備えたハイコンテント細胞イメージングシステムを用いて、蛍光標識された細胞の画像を迅速に取得し、その後、自動画像解析によって特定の細胞特徴を識別・抽出・測定します。得られた測定値の集合が表現型プロファイルを構成し、ヒット選定やクラスタ解析などに活用されます（図1）。

本稿では、GustafsdottirらによるCell Painting（セルペイント）プロトコールに基づいたハイコンテント表現型プロファイリングのワークフローをご紹介します。本ワークフローでは、使いやすさと高品質の両立を実現しており、画像のセグメンテーションおよび測定はIN Carta™ イメージ解析ソフトウェア内で行い、データ解析はHC StratoMineR™で実施します。IN Cartaソフトウェアでは、画像解析ルーチンを調整することで、細胞やオルガネラの堅牢な検出が可能です。また、深層学習によるセマンティックセグメンテーションモジュール（SINAP）を使用することで、検出が困難な特徴の認識精度を向上させることができます。核や細胞の検出には、あらかじめ学習済みのディープラーニングモデルが利用可能であり、さらに、ユーザー自身のデータセットを用いて、特定の対象物に特化したモデルを独自に学習させることも可能です。HC StratoMineRは、大規模かつ多次元のデータセットを処理するために開発されたWebベースのツールです。このプラットフォームは、ハイコンテントデータ解析のためのステップバイステップのガイド付きワークフローを備えており、Webブラウザからアクセスできるため、大規模データの処理に一般的に必要とされる追加の計算リソースは不要です。このワークフローを用いることで、同一化合物で処理した細胞は類似した表現型プロファイルを示すことが確認されました。階層的クラスタリング解析により、パクリタキセルやロテノンといった高い毒性を示す化合物が同じクラスターに分類されました。また、オートファジーに影響を与えるクロロキンやテトランドリン *2 *4 も同一のクラスターに含まれていました。これらの結果は、本ワークフローがユーザーフレンドリーでありながら、ハイコンテント表現型プロファイリングを堅牢に実施できる手法であることを示しています。

方法

細胞培養

U2OS細胞株（ATCC）は、メーカーの推奨プロトコールに従って継代および維持しました。セルペイントアッセイは、Brayらのプロトコールに従って実施しました。簡単に述べると、U2OS細胞をGreiner製の384ウェル μClearプレートに、1ウェルあたり2,000細胞、合計40 µLのMcCoy培地（10% FBS添加）で播種しました。細胞は37°Cで24時間インキュベートした後、化合物処理を行いました。

播種から24時間後、化合物添加前に培地を2%（v/v）FBSを含むMcCoy培地に交換しました。使用した化合物は以下の11種類です：Ca-074-Me、CCCP、クロロキン（Enzo）、サイトカラシンD、エトポシド（Calbiochem）、ラトランクリンB、ラパマイシン（Sigma）、ロテノン（Enzo）、スタウロスポリン、パクリタキセル、テトランドリン（特記がない限り、すべての化合物はSeleckChem社より購入）。各化合物は、7段階の3倍希釈系列で、4ウェルずつ反復して評価しました。同一プレート内には、DMSOコントロール、ネガティブコントロール、およびポジティブコントロールも含めました。細胞は化合物とともに24時間インキュベートしました。

染色

生細胞は、MitoTracker DeepRed（500 nM）で37°C、暗所にて30分間染色しました。その後、3.2%（v/v）のPFAで20分間固定しました。細胞を洗浄後、室温で0.1% Triton X-100を用いて20分間透過処理を行いました。染色液は以下の最終濃度で調製しました：ファロイジン \( \frac{5\,\mathrm{μL}}{\mathrm{mL}} \)、コンカナバリンA \( \frac{100\,\mathrm{μL}}{\mathrm{mL}} \)、Hoechst \( \frac{5\,\mathrm{μL}}{\mathrm{mL}} \)、WGA \( \frac{1.5\,\mathrm{μL}}{\mathrm{mL}} \)、SYTO 14色素 3 μM。これらは、ブロッキング溶液（1X HBSSおよび1%（w/v）BSA）中に調製しました。細胞は洗浄後、室温で30分間染色液とインキュベートしました。染色液を除去した後、細胞を3回洗浄し、接着性ホイルで封止しました。すべての洗浄ステップには1X HBSSを使用しました。

画像取得

画像は、ImageXpress® Micro Confocal ハイコンテントイメージングシステム（モレキュラーデバイス）を用いて取得しました。使用した対物レンズは20X Plan Apoで、共焦点ピンホールサイズは60 µmに設定しました。使用したフィルター（励起/蛍光波長）は以下の通りです：DAPI 377/447、FITC 475/536、TRITC 543/593、TexasRed 560/624、Cy5 631/692。1ウェルあたり4視野を撮像しました。プレートの平坦性の影響によるフォーカスのずれを補正するため、各視野について3枚のZスタック画像を取得し、最適フォーカス投影オプションを使用しました。

特徴抽出

画像解析はIN Cartaソフトウェアを用いて実施しました。画像セグメンテーションのプロトコールは以下のように設定しました。まず、Hoechstで染色された核を、カスタムセグメンテーション（学習済みNucleiモデル）を使用して一次対象としてセグメント化しました。画像の端に接しているオブジェクトは除外しました。細胞のセグメンテーションは、TRITCチャネル内で「Robust」オプションを使用して実施しました。さらに、以下の3種類のオルガネラを指定されたオプションでセグメント化しました：ミトコンドリア（ネットワーク）、アクチン（フィラメント）、小胞体（ネットワーク）。1細胞あたり合計280項目の測定値を出力として選択しました。

データ分析

特徴抽出が完了した後、細胞レベルのデータはCSV形式でエクスポートされ、化合物情報を含むメタデータのテキストファイルとともに、HC StratoMineR（CoreLife Analytics）にアップロードしました。プレートマップはStratoMineRのインターフェース内で定義しました。「Quality Control」タブを使用して、外れ値のウェル（細胞数が50未満のウェル）を解析から除外しました。推奨される手順に従ってデータ変換を行い、その後に特徴量のスケーリングを実施しました。次に、主成分分析（PCA）を用いて次元削減を行い、得られた15個の主成分を用いて「距離スコア（distance score）」を算出しました。このスコアは、各ウェルにおける処理が細胞の表現型に与える影響の大きさを示す指標です。この距離スコアは、ヒット選定や階層的クラスタリング解析に利用することができます。

結果

化合物処理および染色。細胞には11種類の化合物を処理しました。その一部は、過去のセルペイント研究においてリファレンス化合物として使用された実績があります。化合物処理後、細胞は以下の構造体を対象に染色されました：ミトコンドリア、アクチン、ゴルジ体、核小体（RNA粒子）、小胞体（ER）、および核（図2参照）。

IN Cartaソフトウェアを用いて、検出された各細胞から多様な細胞特徴量を抽出しました。このソフトウェアは、A. 直感的なユーザーインターフェースを備えており、B. 表現型プロファイリングにおいて重要な測定項目、すなわち強度、テクスチャ、形状、オルガネラ間の空間的関係といった空間配置、共局在性などを提供します。また、C. 深層学習によるセマンティックセグメンテーションモジュール（SINAP）を活用することで、バイアスのない堅牢な特徴抽出が可能です。さらに、ユーザーが関心を持つ特定の対象物に基づいて、独自の画像データを用いたモデルの再学習も可能です。

本解析プロトコールでは、SINAPモジュールを用いて核の認識精度を向上させました（図3）。内蔵の核モデルは1,000枚以上の画像で学習されており、学習データには、異なる倍率で取得された蛍光および明視野画像、DAPI、Hoechst、ヘマトキシリン・エオシン（H&E）などで染色された核が含まれているため、さまざまな画像に対して高い汎用性を有しています。画像解析のセットアップ時には、この核モデルにより核の検出精度が向上し、接触している核を正確に分離できることが確認されました。細胞質のセグメンテーションには、SYTO14染色を用い、「Robust」セグメンテーション法を適用しました。また、小胞体（ER）、ミトコンドリア、アクチンもそれぞれセグメント化および解析を行いました。さらに、全チャネルにおいて、細胞全体、核、細胞質それぞれに対する総蛍光強度の測定も実施しました。

解析された特徴量は、IN Cartaソフトウェア内で簡単に確認することができます。ヒートマップ表示やヒストグラムといったオプションが用意されており、一般的なデータ探索に活用できます。細胞ごとのデータや要約データはCSV形式でエクスポートでき、後続のデータマイニングや解析に利用可能です（図4）。

データ解析

IN Cartaソフトウェアで取得した測定データはエクスポートされ、その後、さらなるデータ解析のためにHC StratoMineRにアップロードされました。HC StratoMineRはWebベースのハイコンテントデータ解析ツールであり、ガイド付きのプラットフォームにより、データサイエンスの専門知識がなくても解析ワークフローを直感的に操作できる点が特長です。また、Webベースであるため、大規模かつ複雑なデータセットの解析に必要な計算リソースをユーザー側で構築・設定する必要がありません。

280項目の測定値は、一般化加重最小二乗法（generalized weighted least squares）による主成分分析（PCA）を用いて15個の主成分に次元削減されました。その後、階層的クラスタリングを実施し、各ウェル間の関係性をデンドログラムで可視化しました（図5）。同一の化合物で処理された細胞は、同じクラスターに分類される傾向が見られました。たとえば、クラスター9にはスタウロスポリン処理細胞のみが含まれていました。また、細胞に類似した作用を及ぼすことが知られている化合物も同じクラスターに分類されました。たとえば、アクチン重合阻害剤であるサイトカラシンDとラトランクリンBはクラスター6に、オートファジー経路に影響を与えることが知られているテトランドリンとクロロキンはクラスター5に分類されました。これらの結果は、本ワークフローがハイコンテント表現型プロファイリングを実施するうえで、実用的かつ容易に導入可能なアプローチであることを示しています。

結論

• ImageXpress Micro Confocal システムは、ハイコンテントなセルペイントアッセイの撮像に適しています。
• IN Cartaソフトウェアは、使いやすさと高度な特徴セグメンテーション機能（SINAP）を兼ね備えており、細胞特徴の堅牢かつバイアスのない抽出を可能にします。
• StratoMineRプラットフォームは、直感的なガイド付きワークフローにより、データサイエンスの専門知識がないユーザーでも迅速に表現型データ解析を行うことができます。
• 総じて、本研究の結果は、ImageXpress Micro Confocalシステム、IN Cartaソフトウェア、StratoMineRを用いた画像ベースのプロファイリングアッセイが、実用的かつ導入しやすい手法であることを示しています。

参考文献

1. Bray MA, Singh S, Han H, Davis CT, Borgeson B, Hartland C, Kost-Alimova M, Gustafsdottir SM, Gibson CC, Carpenter AE. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 2016 Sep;11(9):1757-74. doi: 10.1038/ nprot.2016.105. Epub 2016 Aug 25. PMID: 27560178; PMCID: PMC5223290.
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6. Omta WA, van Heesbeen RG, Pagliero RJ, van der Velden LM, Lelieveld D, Nellen M, Kramer M, Yeong M, Saeidi AM, Medema RH, Spruit M, Brinkkemper S, Klumperman J, Egan DA. HC StratoMineR: A Web-Based Tool for the Rapid Analysis of High-Content Datasets. Assay Drug Dev Technol. 2016 Oct;14(8):439-452. doi: 10.1089/adt.2016.726. Epub 2016 Sep 16. PMID: 27636821.
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