Application Note 高感度ATP定量｜SpectraMax＋SmartInject

はじめに

アデノシン5´-三リン酸（ATP）はすべての生細胞に存在します。その濃度は厳密に制御されているため、ATPのアッセイは生細胞数の指標として利用できます。ATP測定は、食品、医薬品、ヘルスケア、パーソナルケア産業における原材料や製造設備の衛生管理において、細菌汚染の監視や廃水分析に使用されています *1。 バイオテクノロジーや製薬業界では、ATP測定は細胞増殖や細胞毒性の評価に利用されています。ATPの発光アッセイは、その高感度性と利便性から非常に広く普及しています。本テクニカルノートでは、SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーにSpectraMaxインジェクターカートリッジとSmartInject™テクノロジーを組み合わせ、1ウェルあたり20アトモルまでのATPを高感度に検出し、5桁にわたるダイナミックレンジを実現する方法を紹介します。

アッセイ原理

このアッセイの基本は、アメリカの一般的なホタル（Photinus pyralis）から得られたルシフェラーゼによって触媒される反応です。² この酵素は、ATP依存的にルシフェリンを酸化し、同時に光を放出します（図1）。反応においてATPが律速成分である場合、発光量はATP濃度に比例します。発光強度はSpectraMax i3xプレートリーダーで容易に測定できます。SpectraMaxインジェクターカートリッジは、試薬の正確な分注と、最適な感度を得るために必要なディレイ時間や積分時間の調整を可能にします。

材料と方法

• ENLITEN ATPアッセイシステム（プロメガ）
• ソリッドホワイト96ウェルマイクロプレート（Greiner）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
  ◦SpectraMax インジェクターカートリッジ（モレキュラーデバイス）

アッセイセットアップ

キットに付属する手順書（テクニカルマニュアル Part #TMF004） *3に従いましたが、96ウェルフォーマットに対応するために軽微な修正を加えました。

注記: テクニカルマニュアルには、微生物や哺乳類細胞からのATP抽出を含むサンプル調製に関するセクションも記載されていますが、本テクニカルノートでは扱いません。

1. 酵素およびバッファ溶液は解凍後、氷上に保持しました。rL/L試薬は、再構成バッファをrL/L試薬バイアルに注ぎ、数回穏やかにスワリングした後、室温で1時間静置して再構成しました。
2. 感度とダイナミックレンジを決定するため、ATP標準液を調製しました。まず、ATPストック標準液100 µLをATPフリー水900 µLで希釈し、その後ATPフリー水で10倍連続希釈を行いました。希釈した標準液（10 nM～0.0001 nM）は使用まで氷上に保持しました。
3. 希釈したATP標準液（またはATPフリー水ブランク）をマイクロプレートのウェルに三重測定で分注しました（10 µL/well）。最終的なATP含量は0.01～1000 fmol/wellの範囲でした。

装置セットアップ

SoftMax ProソフトウェアのAcquisition Viewを使用して装置設定を選択しました。このビューは、簡単に構成可能なグラフィカルワークフローを提供します（図2）。ソフトウェアのプロトコールライブラリには、あらかじめ構成されたATPアッセイプロトコールも利用可能です。新しいSmartInjectテクノロジーを使用し、インジェクターによる試薬分注と同時にアッセイプレートをシェイクすることで、試薬の完全な混合を確保しました。

1. 高速キネティックアッセイでエンドポイントアッセイに最適な設定を決定するため、SmartInjectを選択し、ATP希釈液（10 µL/well）を含む選択ウェルにrL/L試薬100 µL（インジェクター1）を分注し、その後、連続した0.5秒間隔で積分を開始し、合計10秒間測定しました。
2. 感度とダイナミックレンジを決定するためのエンドポイント測定では、SmartInjectテクノロジーを使用して各ウェルに100 µLの試薬を分注し、2秒のディレイ後に10秒間の測定を行いました。
3. インジェクター1は、装置のタッチスクリーンで「Prime」をタッチしてrL/L試薬でプライミングしました。これにより、260 µLの試薬が分注され、完全なプライムに十分な量が供給されました。
4. ATP標準液を含むプレートをSpectraMax i3x装置のプレートドロワーにセットし、「Read」ボタンをクリックしてインジェクション／測定サイクルを開始しました。

インジェクターの洗浄

溶媒供給システムの除染は、ATPアッセイで満足な結果を得るために極めて重要です。エタノールによるリンスだけでは不十分です。システムを滅菌するだけでなく、あらゆる由来の残留ATPを破壊し、ブランク値を可能な限り低く維持する必要があります。

装置のタッチスクリーン上の「Wash」機能を、除染に必要なパラメータに合わせて設定しました。インジェクター1は、50％漂白剤（2.5％～3％次亜塩素酸ナトリウム）を少なくとも250 µLポンプし、1時間静置した後、少なくとも2.5 mLの脱イオン水で洗浄しました。次に、75％エタノールを少なくとも250 µLポンプし、1時間静置した後、再度2.5 mL以上の脱イオン水で洗浄しました。最後に、ライン内の液体をすべて除去するために空気でプライミングしました。

結果

ATP反応プロファイル

ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加した際の反応プロファイルを図3に示します。1000 fmol ATP/ウェル存在下（上段プロット）では、発光は1秒以内に最大となり、少なくとも10秒間そのレベルを維持しました。ブランク（下段プロット）はほとんど応答を示しませんでした。データに基づくと、2秒のディレイで十分であり、積分時間は最短で1秒まで短縮可能で、プレート全体の測定時間を短縮できます。

ダイナミックレンジと感度

ATP濃度0.01～1000 fmol/wellの標準曲線を図4に示します。検出限界（ブランク値のゼロから3標準偏差以上のシグナルを生成する量）は約20 amol/wellでした。ダイナミックレンジは約5桁でした。

概要

SpectraMax i3x装置とSpectraMaxインジェクターカートリッジを用いたENLITEN ATPアッセイシステムにより、1ウェルあたり20アトモルまでのATPを検出し、5桁にわたるダイナミックレンジを実現しました。このレベルの感度により、食品、飲料、化粧品などの製品における細菌やその他の微生物汚染、さらにATPを分解する酵素の検出を信頼性高く行うことができます。

SoftMax Proソフトウェアの事前設定済みプロトコールにより、標準曲線の自動プロットやサンプルデータ解析が可能で、アッセイセットアップが簡略化されます。SoftMax ProのAcquisition Viewは、グラフィカルインターフェースを用いてアッセイワークフローを容易に設定できます。SmartInjectテクノロジーは、試薬のインジェクションと混合を同時に行い、完全な試薬混合と迅速な発光シグナルの発現を実現します。これらは、ウェル間のばらつきを最小限に抑えながら、最適なアッセイ感度を得るために不可欠です。

参考文献

1. Jones, D. 1998. Bioluminescence assays using ATP. Luminescence Forum, 4: 1-9.
2. DeLuca, M.A. and W.D. McElroy, (1978) in Meth. Enzymol., 53:3.
3. Promega Corporation: 

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