Application Note Romer Labs AgraQuant メラミンアッセイによるハイスループットなメラミン検出

はじめに

有機塩基であるメラミンは、プラスチック、難燃剤、顔料、肥料など、多くの製品の製造に使用されています。最近、見かけ上のタンパク質含有量を増やすために、メラミンを家畜飼料や食用食品に添加する行為が報告されています。メラミン汚染は動物や人間に深刻な病気や死をもたらす可能性があるため、様々な食品中のメラミン汚染を検出する方法の特定に関心が高まっています。このアプリケーションノートでは、Romer Labsの2種類のメラミンELISAアッセイキット、AgraQuantメラミンアッセイと AgraQuantメラミンSensitiveアッセイを紹介し、そのバリデーションを行います。

AgraQuant メラミンアッセイは、メラミンを定量するための直接競合型酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）で、小麦グルテンやペットフードでの使用を目的としています *1。AgraQuant メラミン Sensitive アッセイは、牛乳、粉ミルク、その他の乳製品で有効性が確認されている、より感度の高いELISAです *2。両アッセイとも、検体と酵素結合メラミンを、メラミン抗体でプレコートされたマイクロウェルに分注します。被験試料と標準物質は、酵素標識メラミンと抗体への結合を競合します。インキュベーション後、マイクロウェルを洗浄し、基質を加え、2回目のインキュベーションを行います。2回目のインキュベーション後、Stop Solutionを用いて反応をクエンチし、マイクロプレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定。混合液の色の濃さは、標準品またはサンプル中に存在するメラミンの量に反比例します。試験サンプルのメラミン濃度は、メラミン標準曲線を用いて補間されます。

メラミン測定における吸光度の検出には、モレキュラーデバイスの吸光マイクロプレートリーダーが使用されます。データ収集と分析は、FDA 21 CFR Part 11準拠の業界標準分析ソフトウェアであるSoftMax® Pro GxPソフトウェアであらかじめ設定されたメラミンELISAプロトコルを使用して実行されます。

材料

• 吸光度検出モード付きモレキュラーデバイス マイクロプレートリーダー：
  ◦SpectraMax ® Plus 384
  ◦SpectraMax 190
  ◦SpectraMax 340PC384
  ◦VersaMax™ 
  ◦SpectraMax M2/M2 e
  ◦SpectraMax M5/M5 e
  ◦FlexStation ® 3
  ◦SpectraMax i3x
  ◦SpectraMax iD3
• AgraQuant メラミン検査キット (Romer Labs)
• AgraQuant メラミン高感度テストキット (Romer Labs)

方法

両キットとも、以下の手順で行いました：

試薬は使用前に室温に平衡化しました。

テストウェルをマイクロウェルストリップホルダーにセットしました。未使用のウェルは、乾燥剤を入れたプラスチック袋に密封しました。

150µLのメラミン標準物質をシングルチャンネルピペットでテストウェルに加え、分注ごとに新しいチップを使用しました。メラミンアッセイキットには0、20、100、500ppbの標準物質が、Melamine Sensitive Assayキットには0、20、100、1000ppbの標準物質が含まれています。

8チャンネルピペットを用いて、各ウェルに50μLのコンジュゲートを分注しました。

プレートを60秒間静かに回転させた後、室温で30分間インキュベートしました。

ウェルの内容物を吸引し、ウェルを400μLの脱イオン水で合計4回洗浄しました。

2回目の洗浄後、プレートを吸光度紙の上に倒立させ、残った洗浄液を除去しました。

マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルに100µLの基質を加えました。プレートを室温で20分間インキュベートしました。

マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに100μLの停止液を加えました。

SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルを用いて、VersaMaxマイクロプレートリーダーでウェルの吸光度を450 nmで読み取りました。

キャリブレーションは、SoftMax Proソフトウェアの半-logカーブフィット処理を用いてプロットしました。

結果

光学濃度（OD）値は、ゼロppb標準（B/B₀）のOD値に対するパーセンテージとして表され、半対数応答曲線を構築するために使用されました。サンプルのメラミン含有量は、標準曲線から補間することができます。検体に500ppb（通常キット）または1000ppb（高感度キット）以上のメラミンが封じ込められ ている場合は、正確な結果を得るために検体をさらに希釈し、再分析する必要があります。試料中に基準値20ppb未満のメラミンが封じ込められ ている場合、結果は「< (20 x 希釈倍率) ppb」と報告する必要があります(*1, *2)。

図1はlogit(B/B₀)対log(濃度)でプロットしたメラミン測定の標準曲線で、Bは各標準物質の平均吸光度値、B₀は0ppb標準物質の平均吸光度です。図2はメラミン高感度測定法の標準曲線を示しています。r²値は各標準曲線で0.999であり、メラミン測定法では0.985以上、メラミン高感度測定法では0.990以上というRomer Labsの推奨値を満たしています。50％阻害率は、メラミンアッセイで124.2、Melamine Sensitive Assayで77.4ppbと算出されました。両値とも、各キットの性能証明書に示された値と同等でした。

図1. メラミン検査キットの標準曲線。20、100、500ppbのメラミン標準試料をlogit(B/B₀)対log(濃度)でプロット。r² = 0.999. 50%阻害 = 124.2 ppb。

図2. メラミン感受性試験キットの標準曲線。20、100、1000ppbのメラミン標準物質をlogit(B/B₀)対log(濃度)でプロット。r² = 0.999. 50％阻害＝77.4ppb。

メラミン検査キットおよびメラミン高感度検査キットの性能証明書に記載されている検査再現性のデータによると、標準物質の分散係数（CV）は9%未満です。このアプリケーションノートでは、すべての標準物質のCVsが5%以下であることを実証しています。(表1と表2を参照）。

表1. メラミン検査キット。平均OD、標準偏差、平均B/B₀、およびCVsは、SoftMax Proソフトウェアで計算しました。CVs≦5%は、Romer Labsが各試験キットに対して提供した性能証明書に示されたCV<9%と比較して良好です。

表2. メラミン感受性試験キット。平均OD、標準偏差、平均B/B₀、およびCVsはSoftMax Proソフトウェアで算出しました。CVs≦5%は、Romer Labsが各検査キットに対して提供した性能証明書に示されたCVs<9%と比較して良好です。

結論

Romer Labs 社のメラミン検査キットおよびメラミン Sensitive 検査キットは、モレキュラーデバイスのSpectraMax、VersaMax、VMax、EMax マイクロプレートリーダーとともに、牛乳、粉ミルク、ヨーグルト、小麦グルテン、湿潤および乾燥ペットフードなどの食品中のメラミン汚染を検出するための品質保証スクリーニングソリューションを提供します。完全なデータ解析は、FDA 21 CFR Part 11準拠の業界標準解析ソフトウェアであるSoftMax Pro GxPソフトウェアによって提供されます。

モレキュラーデバイスのAquaMax® 4000マイクロプレートウォッシャーは、ELISA洗浄ステップの自動化を可能にし、モレキュラーデバイス StakMax®マイクロプレートハンドリングシステムと統合してスループットを向上させることができます。また、StakMaxシステムをモレキュラーデバイス SpectraMaxおよびVersaMaxマイクロプレートリーダーと組み合わせることもできます。これらの組み合わせは、手作業によるプレートハンドリングを最小限に抑えながら、スループットを最大化します。

参考文献

1. AgraQuant Melamine Test Kit product insert and Certificate of Performance.
2. AgraQuant Melamine Sensitive Test Kit product insert and Certificate of Performance.

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