Application Note がん毒性研究のためのマルチプル高密度スキャフォールドフリー スフェロイドを用いた
3D細胞培養のハイスループットスクリーニング

はじめに

Angeline Lim博士｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

がん研究のための3Dスフェロイドモデルは、従来の2D培養モデルと比較して、腫瘍のin vivo組織構造、遺伝子発現、代謝プロファイルをよりよく模倣できるため、人気が高まっています*1,*5,*6。これまでの研究で、3D培養は、セル-細胞/ECM相互作用、薬剤の浸透性、用量反応性、抵抗性など、いくつかのin vivo腫瘍の特徴を示すことが示されています7。固形腫瘍と同様に、スフェロイドは外側の細胞増殖ゾーン、中間の静止細胞層、そして細胞が低酸素状態にさらされる内側の壊死コアから構成されています。これらの類似性から、3Dモデルは薬剤の安全性をよりよく評価し、抗がん化合物の同定に成功することが示唆されます*4。

スフェロイド作製には様々な技術が開発されている。基本的に、これらのアプローチは、細胞接着抵抗性表面か、細胞間相互作用を促進する物理的な力のいずれかを使用します。スピナーフラスコ／NASAバイオリアクターシステムは、細胞がフラスコ表面に接着しないように連続的な運動を利用し、細胞間接着を促進します。磁気浮上法は、磁場を利用して酸化鉄ナノ粒子を封じ込めた細胞をクラスタリングし、スフェロイドを形成します。スピナーフラスコ法と磁気浮上法は、大量のスフェロイドを生成することができるが、均一性が悪く、球状のスフェロイドの比率は低いです2。ハンギングドロップ法では、培養皿の底から細胞懸濁液を滴下します。この液滴で形成されたスフェロイドを細胞培養プレートに移し、さらにアッセイを行います。

オートメーションなしでは、この手法は労力と時間がかかるため、小規模な研究に限定されます。スフェロイドを作製する一般的な方法は、付着性の低い材料でコーティングされた丸底のU字型ウェルを持つプレートを用いるものです。スキャフォールドを使わないこの方法は、ワークフローが比較的簡単で、ハイコンテントイメージャーに適合します。加えて、スフェロイドのサイズを容易に制御でき、スフェロイドの均一性も高いです2。アッセイ時間を短縮し、ばらつきを最小化するワンステップ染色手順で、丸底プレートでのワークフローを最適化する研究がこれまでに行われています3。しかし、Uボトムプレートを使用する際の欠点は、各ウェルで単一のスフェロイドしか作製できないことです。データポイントを増やすには、ウェルの複製が必要となり、時間がかかり、試薬や試験化合物の使用量が増えるため、最終的にスクリーニングコストが上昇します。

複数の安定したサイズのスフェロイドを作製するためのソリューションとして、付着性の低い表面にパターニングされたマイクロウェルのアレイが登場しました。Corning® Elplasia® プレートは、標準的な培養プレート（6ウェル、24ウェル、96ウェル）内にマイクロキャビティを設けたデザインです。各ウェルは、スフェロイド形成を可能にする超低付着面でコーティングされています。1ウェルあたり1個のスフェロイドを形成するU底プレートでの標準的なワークフローと比較して、エルプラシア・プレートは96ウェルプレートで1ウェルあたり平均78個のスフェロイドを形成することができます。これにより、複数のスフェロイドを同じ条件下で成長させ、処理することができ、データ出力を最大化することができます。さらにこの方法は、腫瘍組織のクローン不均一性を研究したり、遺伝子発現やメタボローム・プロファイリング用の材料を増やしたりするのにも応用できます*5,*8。

ここでは、スフェロイド作製、化合物処理、細胞毒性アッセイ、ImageXpress® Micro Confocalハイコンテントイメージングシステムでのハイコンテントイメージング、MetaXpress® ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアを用いた3D画像解析を含む3D培養ワークフローで、エルプラシア96ウェルプレートの使用を実証します。複数のスフェロイドを容易に作製し、ハイコンテントイメージャーとシームレスなワークフローを統合する能力は、創薬や化合物の毒性学において重要な応用が期待されます。

方法

細胞培養

スフェロイドの作製にはHCT116細胞株（ATCC）を用いた。Elplasiaプレートはあらかじめ湿潤させ、メーカーのプロトコールに従ってハンドリングしました。細胞をElplasia 96ウェルプレート（#4442）に50,000個、合計100μLのMcCoy培地（10%FBS添加）にプレーティングしました。細胞を37℃で24時間インキュベートし、化合物処理前にスフェロイドを形成させました。

化合物を添加する前に、スフェロイドの形成を確認するため、細胞を組織培養顕微鏡で目視検査しました。ここでは以下の化合物を用いた： シタラビン、ドキソルビシン（Dox）、エトポシド、スタウロスポリン、タキソール。化合物は、7点、1：5希釈系列とコントロールの二重ウェルで試験しました。スフェロイドは化合物と合計6日間インキュベートし、3日目に新しい化合物を加えました。

染色

生細胞毒性アッセイのために、スフェロイドは以下の色素の混合物で染色しました： 3 µM Calcein AM（Life Technologies）、2 µM Ethidium Homodimer III（EthD-III）（Molecular Devices）、33 µM Hoechst 33342（Life Technologies）。色素溶液は使用直前に調製し、各ウェルに合計 10 µL 添加しました。スフェロイドを色素とともに37℃で2時間半インキュベートした後、イメージングを行いました。

画像取得

ImageXpress® Micro Confocalシステム（モレキュラーデバイス）を用い、10X対物レンズで画像を取得しました。共焦点ピンホールサイズ＝60μm。スフェロイドの体積の少なくとも半分をカバーするように、5 µmのステップサイズで12枚の画像をスタックしました。

解析

MetaXpress®ソフトウェアのカスタムモジュールエディターを用いて3D画像解析を行いました。解析では、3D機能Find Spherical Objectsアルゴリズムを用いて、Hoechst染色画像を用いてスフェロイドを同定しました。Count Nucleiモジュールは、Hoechst染色に基づいて細胞の総数を特定するために使用しました。Live/deadモジュールは、死細胞（EthD陽性）と生細胞（Hoechst陽性、Eth陰性）の数を定量化するために使用しました。死細胞はもはやHoechst染色を示さない可能性があるため、Cell Scoringモジュールを使用して、すべてのEthD陽性細胞を同定しました。全平面における全細胞、生細胞、死細胞の対物レンズは、Connect by Best Matchアルゴリズムを用いて3Dオブジェクトを形成するために連結されました。用量反応解析は、SoftMax® Proソフトウェアで4パラメータロジスティックカーブフィットを用いて行いました。統計解析とグラフはMicrosoft Excelで行いました。

結果

代表的なスキャフォールドを使用しないスフェロイド作製法では、1ウェルに1個のスフェロイドを作製する超低吸着Uボトムプレートを使用します。データポイントを増やすには、ウェルの複製が必要となり、多くの場合、手間がかかり、結果的にスクリーニングコストを押し上げることになります。エルプラシア96ウェルプレートは、1ウェルに78個ものスフェロイドを形成することができ、各スフェロイドはマイクロウェルに入れられます。このマイクロウェルで形成されたスフェロイドは、サイズと形状が一定であるため、再現性が向上します（図1）。このプレートはImageXpressハイコンテントイメージングシステムと互換性があり、使用するアッセイによって異なる生物学の出力が可能です。

スフェロイドを異なるクラスの抗がん化合物で6日間処理し、細胞生存率を評価しました。スフェロイドはHoechst（核）、Calcein AM（生細胞）、EthD（死細胞）で染色しました（図2および3）。スフェロイドへの妨害を最小限にし、染色プロセスを簡略化するため、色素はインキュベーション後も洗い流さず、ウェルに残しました。

細胞生存率に対する化合物処理の影響を定量化するために、MetaXpressソフトウェアでカスタムモジュールエディター(CME)を用いて画像を3D解析した。スフェロイドの直径、体積、死細胞と生細胞の数を測定しました。

化合物処理の結果、細胞毒性および細胞静止効果が観察されました。全体として、全ての化合物において生細胞数（EthD陰性）の減少が観察されました。死細胞（EtHD陽性細胞）の数は、特にスタウロスポリンとドキソルビシンでの処理の結果増加し、細胞毒性効果を示しました。細胞の総数は、タキソールおよびエトポシドで処理した結果減少し、試験した濃度におけるこれらの化合物の細胞毒性効果の大部分を示しました（図4Cおよび4D）。

処理したスフェロイドでは、濃度依存的に生細胞の減少が観察された。シタラビン、ドキソルビシンおよびシタラビンで処理すると、濃度依存的に生細胞数が減少し、それに対応して死細胞数が増加した。タキソールで処理したスフェロイドはスフェロイドサイズの減少を示したが、生細胞数は減少しなかったことから、細胞毒性作用が示唆された。細胞毒性はタキソールの濃度が高い場合（13.3μM）に認められ、生細胞数は3倍減少しました。

また、直径と体積を測定することで、スフェロイドの大きさに対する化合物の影響も評価しました（図4B）。興味深いことに、化合物で処理したスフェロイド（シタラビン、ドキソルビシン、スタウロスポリン、タキソール）は、コントロールサンプルと比較して、観察された直径に有意差を示しませんでした。しかし、処理したスフェロイドは、コントロールと比較してスフェロイド体積の有意な減少を示しました。直径の減少を伴わないスフェロイド体積の減少は、3D形態がもはや維持されていない崩壊したスフェロイド構造を示しています。直径は2D解析だけで測定できるため、体積と直径の違いは、スフェロイドに対する化合物の毒性の影響を調べるには、3D解析を用いる方がより代表的であることを示唆しています。

スフェロイド中の生細胞数は、表現型変化を引き起こす化合物の有効濃度を決定するために使用できるが、3D解析による他の測定値から、特異性効果に関する追加情報（死細胞数、総細胞数、強度など）を得ることができます。

結論

複数のスフェロイドをCorning Elplasia 96ウェルマイクロプレートで容易に作製し、化合物で処理、染色した後、ImageXpress® Micro Confocalシステムでイメージングできることを示します。MetaXpress®ソフトウェアを用いたスフェロイドの3D画像解析により、スフェロイドに対する化合物の効果を定量的に評価することができます。開始から終了までのワークフローは、3D培養を用いた迅速な薬剤スクリーニングのために最適化されています。

参考文献

1. Nath, S. & Devi, G. R. がん研究における3D培養システム： 腫瘍スフェロイドモデルを中心に。Pharmacol. Ther. 163, 94-108 (2016).
2. Zanoni, M., Piccinini, F., Arienti, C. et al. in vitro治療スクリーニングのための3D腫瘍スフェロイドモデル：得られたデータの生物学的関連性を高める体系的アプローチ。Sci Rep 6, 19103 (2016).
3. Sirenko O, Mitlo T, Hesley J, Luke S, Owens W, Cromwell EF. 3D がんスフェロイド培養の生存率と形態を特徴付けるハイコンテントアッセイ。Assay Drug Dev Technol. 2015;13(7):402-414.
4. Kimlin LC, Casagrande G, Virador VM. がん研究におけるin vitro 3Dモデル：最新情報。Mol Carcinog. 2013;52(3):167-182.
5. ラット肝組織、単層およびスフェロイド培養肝細胞における遺伝子発現の比較解析。細胞 組織 臓器. 2010;191(4):281-288.
6. 単層培養と3Dスフェロイド培養で異なる代謝プロファイルを示すMG-63ヒト骨肉腫細胞：(1)H NMR研究。FEBS Lett.
7. Fischbach C, Chen R, Matsumoto T, et al. 3Dスキャフォールドを用いた腫瘍エンジニアリング。Nat Methods. 2007;4(10):855-860.
8. Greaves M, Maley CC. がんにおけるクローン進化。Nature. 2012;481(7381):306-313. 2012年1月18日発行。