Application Note ホモジニアス細胞毒性アッセイ

ClonePix™（検証済みアッセイ）

はじめに

細胞の健全性を判定するアッセイは、薬剤スクリーニング環境において重要である。Active Motif (Carlsbad, CA)のClonePix™ Cell Viability Assay Kit (Cat. # 18010)は、集団内の細胞の生存率を測定するシンプルな2色アッセイです。このキットは、細胞内エステラーゼ活性と細胞膜の完全性に基づいて生細胞を同定する。死細胞は、細胞膜の完全性の喪失によって同定される。このアッセイは、ほとんどの真核細胞タイプに適しており、検証済みです。生細胞では、細胞内エステラーゼの活性により、非蛍光性の細胞透過性カルセインAMが、515 nmに発光極大を持つ蛍光性カルセインに変換される。死んだセルでは、エチジウムホモダイマー-1（EthD-1）が傷ついた膜を持つ細胞に入り、核酸との結合によって蛍光が増強され、635 nmに発光極大を持つ明るい赤色の核蛍光を生じる。EthD-1は、生細胞に見られる無傷の細胞膜からは排除される。ImageXpressベロスシステムは、迅速、簡便、ハイスループットの均一性（洗浄なし）細胞毒性アッセイに理想的なプラットフォームを提供する。ここでは、ハイスループット条件下での自動ClonePix™ アッセイ解析に重要な柔軟性を備えた統合画像取得・解析モジュールを紹介します。

アッセイ手順

HeLa細胞を黒壁透明底96ウェルポリスチレンプレートに、50μlの増殖培地中に2,500細胞／ウェルの密度でプレーティングし、5％CO₂インキュベーター内で37℃で一晩培養した。増殖培地を除去し、細胞を血清無添加のPBSまたはMEM（50μl/ウェル）中の様々な濃度のサポニンにさらし、5％CO₂インキュベーター中、37℃で30分間処理した。処理後、細胞をカルセインAMとEthD-1（50μl/ウェル、いずれも0.5μM）で、37℃、5% CO₂インキュベーター内で30分間染色した。各96ウェルプレートを5 x 5ミクロンサンプリングで4分間でスキャンした。

結果と考察

ImageXpress®Velosシステムは488nmレーザーで構成された。カルセイン（緑色）蛍光の発光は、チャンネル1（Ch1）用に510～540 nmのバンドパスフィルターでフィルタリングされ、EthD-1（赤色）はチャンネル3（Ch3）用に600 nmのロングパスフィルターでフィルタリングされた。96ウェルプレートをImageXpress Velosシステムのプレートネストにセットしてスキャンを行い、PMTゲイン、細胞数測定条件、生細胞/死細胞基準を含むすべてのデータ取得およびプロセス設定は、ClonePix™メソッドによって自動的に設定された。画像解析はスキャンと同時に行われ、結果はスキャン後すぐに見ることができる。結果は、各ウェルの細胞ごとのデータを列挙したリストファイル（.csv）と、生細胞率、死細胞率、生細胞数、死細胞数をプレートレイアウトフォーマットで示したサマリーテキストファイルとして保存されます。

生細胞対照群と死細胞対照群のホールウェル画像結果を図1に示す。セルごとの散布図を図2に示すが、2つのグループ間で優れた識別が観察された。Ch1/Ch3比が0.53を超えるセルは生細胞としてグループ化され、Ch1/Ch3比が0.53未満のセルは死細胞としてグループ化される。この比率は、図2のプロットではマゼンタの線でグラフ化されている。細胞毒性アッセイにおける生細胞数と死細胞数の定量は、カルセインシグナル（Ch1）とEthD-1シグナル（Ch3）の比を比較することにより行う。図3には、サポニン処理後の細胞の生存率をプレート形式で示したヒートマップが示されている。サポニンの濃度依存性効果を図4に示す。

結論

ImageXpress VelosシステムスキャニングプラットフォームとBlueImage細胞解析ソフトウェアは、ClonePix™細胞生存率アッセイキットを用いた細胞毒性試験で実証された。その結果、HeLa細胞では、このアッセイの色素濃度を、カルセインAMとEthD-1の両方で最終濃度0.5μMまで低減できることが示された。ハイスループットでホモジニアスフォーマットのウェルスキャンが可能なため、プライマリースクリーンとして細胞毒性アッセイを実施することができます。ImageXpress Velosシステムは、細胞毒性スクリーニングアッセイのより使いやすい定量を必要とするラボにとって魅力的なソリューションです。ClonePix™ アッセイで示されているように、ImageXpress Velos システムは、ハイスループット条件下での画像解析手順の開発、実行、検証に重要な柔軟性を備えた画像取得および解析モジュールを統合したプラットフォームを提供します。このプラットフォームのユニークな光学系とスキャニングエンジンにより、シンプルな "プラグ・アンド・プレイ "アプリケーションが可能になり、学術界と産業界の両方におけるライフサイエンス研究のニーズを満たすことができる。

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