Application Note SpectraMaxマイクロプレートリーダーを用いた均一性、
ハイスループットなエピジェネティクスアッセイ

はじめに

エピジェネティクスは、細胞分裂間で安定し、世代間で遺伝する可能性があるが、DNA配列そのものは変化しない遺伝子発現の変化を含む。エピジェネティクスは生物の多くの重要な側面を制御しており、幹細胞機能や癌への関与は活発な研究分野である。

エピジェネティクスの研究の多くは、ヒストンとその関連タンパク質の相互作用に焦点を当てている1。ヒストンのリジン残基のアセチル化は、遺伝子の転写をエピジェネティックに制御するのに重要である。アセチル化されたヒストンは、ブロモドメインとして知られる小さなタンパク質ドメインを通して認識され、タンパク質と結合する。そのようなタンパク質の一つがBRD4で、BETファミリーのメンバーであり、そのメンバーは炎症、遺伝子発現、有糸分裂、その他の細胞プロセスに関与している2。ブロモドメインとヒストンの相互作用を阻害する低分子化合物は、ヒト疾患の治療薬としての可能性がある3。

Cayman ChemicalのBRD4ブロモドメイン1（BRD4-B1）キットは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（TR-FRET）を用いて、ブロモドメイン／アセチル化ペプチド相互作用の阻害剤を迅速に特性評価する（図1）。TR-FRETドナーはEu3+キレート標識BRD4-B1タンパク質で、ビオチン化ペプチドリガンドに結合します。TR-FRETアクセプターは、ビオチン部分を介してペプチドリガンドに結合したアロフィコシアニン（APC）標識アビジンからなる。阻害化合物などによりBRD4-B1/リガンド相互作用が阻害されると、TR-FRETシグナルが消失する。時間分解検出を用いることで、シグナル対ノイズ比が向上し、化合物の蛍光の影響を最小限に抑えることができるため、TR-FRETアッセイは特にハイスループットスクリーニングアプリケーションに有用である。このアプリケーションノートでは、BRD4ブロモドメイン1 TR-FRETアッセイキットとSpectraMaxマルチモードマイクロプレートリーダーを組み合わせて使用し、BRD4の既知の阻害剤を使用してIC50データを取得します。Z'ファクターは0.91であり、スクリーニング用のロスト性アッセイであった4。

図1. BRD4 bromodomain 1 TR-FRET アッセイキットのアッセイ概略図。ユーロピウムが励起されると、APCがユーロピウムに近接していれば、ユーロピウムキレートは光子を放出するか、そのエネルギーをAPCに伝達することができる。

材料

• BRD4 bromodomain 1 TR-FRET Assay Kit (Cayman Chemicals社、カタログ番号600520)
• JQ-1（+）阻害剤（Cayman Chemicalsのカタログ#11187）
• 384ウェル低容量ソリッドブラックプレート (Cayman Chemicals cat. #400093)
• ジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma cat.）
• SpectraMax® i3 マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）
• SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）
• SpectraMax® M5eマルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）

アッセイのセットアップと検出

BRD4 bromodomain 1 TR-FRET アッセイは、アッセイキットのマニュアルに記載されているとおりに実施した。1μMから始まるJQ1の2倍希釈系列（DMSO中）を調製した。アッセイは、表1に示すプレーティングスキームと容量を用い、低容量の384ウェルブラックプレートにセットアップした。室温で1時間インキュベートした後、SpectraMax i3リーダー、SpectraMax Paradigmリーダー、SpectraMax M5eリーダーで、表2に示す最適化設定を用いてプレートを読み取った。SpectraMax i3およびSpectraMaxマイクロプレートリーダーでは、各ウェルの中心から正確に読み取るためにマイクロプレートの最適化を行いました。

表1. ブロモドメインTR-FRETアッセイキットのピペッティングスキーム。

表2.SpectraMax i3およびSpectraMax Paradigmリーダーの最適化されたインストゥルメンテーション設定。検出カートリッジには励起光源と光学系が含まれています。時間分解蛍光検出を搭載した SpectraMax M5 リーダーにも同様の Wavelength、delay、積分設定を用いた。

別の実験では、Z'因子を計算するために、ビヒクルコントロールと10μM(+)-JQ1阻害剤コントロールをそれぞれ168反復した。ビヒクルコントロールには、阻害剤のアッセイ条件に合わせるため、8％DMSOを含むアッセイバッファーを封じ込めた。Z'ファクターは前述の方法で算出した4。

結果

テストした3台のSpectraMaxリーダーすべてで、ロバスト性の結果が得られた。SpectraMax i3リーダーで検出された(+)-JQ1の代表的な阻害曲線を図2に示す。このデータをSoftMax® Proソフトウェアで4パラメータのロジスティック方程式に当てはめ、IC50値を111 nMと算出した。これは、アッセイキットのマニュアルに記載されている77 nMという値と一致している。図3に示すように、計算されたZ'ファクターは0.91であり、このアッセイはハイスループットスクリーニングに最適である。

図2. JQ1(+)コントロール（IC50 = 111 nM）の濃度を減少させながら処理したBRD4-BR1の阻害剤応答曲線。

図3. BRD4 bromodomain 1 TR-FRET Assay Kitの典型的なZ'ファクターデータ。(+)-JQ1コントロールウェルには10μM阻害剤を封じ込め、ビヒクルコントロールウェルには8%DMSOを含むアッセイバッファーを封じ込めた。この実験から計算されたZ'ファクターは0.91であった。赤の破線は、各コントロール値の平均からの3標準偏差に対応する。

結論

BRD4 bromodomain 1 TR-FRET Assay KitとSpectraMaxリーダーを組み合わせることで、正常な有糸分裂とDNA複製を担うブロモドメインとアセチル化ペプチド間の相互作用の阻害剤をスクリーニングするための、高感度で信頼性の高いソリューションを提供できる。このアッセイは、ますます重要性を増しているエピジェネティクスの分野において、新しい治療薬を発見するための有用なツールを研究者に提供する。

参考文献

1. DeAngelis JT, Farrington WJ, Tollefsbol TO. An overview of epigenetic assays. Molecular Biotechnology 38.2 (2008)： 179-183.
2. BETブロモドメインの選択的阻害。Nature 468.7327 (2010)： 1067-1073.
3. Dimond PF. エピジェネティクス・ターゲットは、新規薬剤の発見を可能にするかもしれない。Gen Eng. & Biotech. News, 24 Oct. Web. 30 Jan. 2015
4. Zhang JH, Chung TDY, Oldenburg KR. 1999. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screening 4.2 (1999)： 67-73.