Application Note 均一性ハイスループット生細胞GPCR結合アッセイ

はじめに

ライブセルスクリーニングのために

Molecular Devices社は、蛍光測定を用いたマルチウェルプレート内の細胞のマルチパラメトリックスクリーニングのための強力な新しいスクリーニングプラットフォーム、ImageXpress® Velosシステムを開発しました。ImageXpress Velos システムの光学系は、検出領域が限定されているため、蛍光が収集される領域が、接着細胞が存在するサンプルプレーン近傍に限定されます。これにより、バックグラウンド蛍光が減少し、細胞結合シグナルの測定が向上します。このシステムは、フォーカスを合わせる必要なく、プレート全体にわたって鮮明な画像を収集することができ、プレートのウェル密度に関係なく、10ミクロンの解像度でプレート全体を120秒でスキャンします。これらの特長により、ImageXpress Velosシステムは、ハイスループットのライブセル結合アッセイに理想的です。

本報告では、ImageXpress Velosシステムレーザースキャニングプラットフォームを用いて、M1ムスカリン性アセチルコリン受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞へのCy3標識テレンゼピン（Cy3-TP）のライブセルバインディングアッセイを実証しました。この重要なGタンパク質共役型受容体(GPCR)からの特異的結合、Cy3標識非ペプチドリガンドの競合および置換を示すために、アトロピンを用いて選択性を評価しました。

アッセイ手順

セル播種とCy3-TP結合アッセイ手順。ライブセル結合アッセイは96ウェル黒壁Packard Viewプレートで行いました。プレートには、M1ムスカリン性アセチルコリン受容体を発現するCHO細胞（セルおよび試薬はAmgen社（Thousand Oaks）から提供）を播種しました。マルチウェルプレートは、使用前に5% CO2インキュベーター内で37℃でインキュベートしました。細胞結合反応は、96ウェルプレートを用いて室温で行いました。

オンレート手順。オンレート研究では、細胞を40μlの2μMアトロピン単独または併用封じ込め、続いて40μlの10nM（最終濃度）のCy3-TPに曝露しました。なお、最終アトロピン濃度は1μMでした。プレートは、最初の30分間は5分ごとに、その後135分までは10分ごとにスキャンしました。

Cy3-TP結合の選択性。セルを40μlの指示濃度のアトロピン、続いて40μlの8nM Cy3-TPに曝露しました。この結果、競合試験の最終濃度は4nMとなりました。結合の60分後にプレートをスキャンしました。

Cy3-TP結合の検出。ImageXpress Velosシステムレーザースキャニングプラットフォームは、560-610nm（オレンジ）バンドパスフィルターを用いたCh3によるCy3蛍光の1チャンネル取得用にセットアップされました。画像取得は5×5ミクロンサンプリングで行い、96ウェルプレート全体をスキャンしました。

生細胞染色とCMFDAの検出。生細胞蛍光色素5-クロロメチルフルオレセインジアセテート（CMFDA）はInvitrogen社（Carlsbad, CA）から入手し、結合反応後の細胞を標識するために0.1μMで使用しました。簡単に言うと、CMFDAの2X溶液をバッファーで調製し、80μlを各ウェルの結合反応に添加しました；この結果、0.1μMのCMFDAの最終容量は160μl/ウェルとなりました。細胞をCMFDAとともに室温で30分間インキュベートした後、Ch1 510-540nm（緑）バンドパスフィルターを用いてスキャンしました。画像取得は5×5ミクロンサンプリングで行い、96ウェルディッシュ全体をスキャンしました。

結果と考察

オンレートの結果。細胞を5000個/ウェルで播種し、選択したウェルに40μlの結合バッファー単独または2μMのアトロピンを封じ込め、その後40μlの終濃度10nMのCy3-TPを作用させました。プレートはImageXpress Velosシステムで均一性フォーマットで複数の時点でスキャンしました。10nMのCy3-TPでインキュベートした細胞の結合時間コースの代表的な画像を図1（トップパネル）に示します。Cy3-TP応答は、各ウェルの中心に直径4 mmの関心領域（ROI）を定義し、そのROI内のCy3シグナルを閾値処理し、Cy3蛍光の総量を積分し、バックグラウンドシグナル値（ROI内の閾値を超えないシグナル）を差し引くことで評価しました。結合反応に10 nM Cy3-TPを用いた場合、陽性コントロール（アトロピン（Atr）なし）と陰性コントロール（1 μM Atr）の間で優れた識別が観察されました（図1）。

Cy3-TP結合の選択性。ホモジニアスCy3-TP結合アッセイにおけるアトロピン濃度応答曲線をホモジニアスアッセイフォーマットで評価しました。アトロピン濃度による明確な傾向が観察されましたが、低アトロピン濃度でのシグナルの飽和は認められず、細胞正規化の方法が結合アッセイを改善することが示唆されました。全細胞数に正規化するため、細胞を3.7%ホルムアルデヒドを封じ込めたPBSで固定し、0.1μg/mlのヨウ化プロピジウム（PI）で染色しました。プレートをスキャンし、650nmのロングパスフィルターを用いてPIシグナルを別チャンネルに集めました。これにより、Cy3シグナルとの優れた識別が可能となりました。PIシグナルを閾値処理することでセルを同定し、SB比を差し引いた平均Cy3反応を算出しました。これにより、ウェル全体の正規化されたCy3-TP応答が得られます。この方法で決定されたアトロピン応答曲線を、10種類のアトロピン濃度と1種類のブランク（明瞭化のため0.016nMでプロット）について図2に示します。

セル正常化のためのCMFDA染色。2倍濃度のCMFDAを封じ込めた等容量のバッファーを加える、より効率的なワンステッププロセスが示されました（図3）。結合反応後、細胞を0.1μMのCMFDAで室温で30分間標識し、510-540nmのバンドパスフィルターを用いてCMFDAシグナルを別のチャンネルに集めました。図3に示すように、CMFDA標識細胞はCMFDAシグナルの閾値処理によって同定されました。このように、シンプルなワンステッププロセスにより、バックグラウンド減算した平均Cy3応答を計算し、ROI全体の細胞について正規化することができます。

Off-Rateの結果 2500細胞/ウェルで播種したセルを用いてOff-Rate試験を行いました。細胞は4nM Cy3-TPで1.5時間インキュベートされ、その後100nMアトロピンから始まる連続1:3希釈液が添加されました。オフレート試験はホモジニアスで行われ、データは2時間にわたって一定間隔で収集されました。Cy3-TPシグナルの変化率（5分時点との相対値）が計算され、オフレート値は予想通りアトロピン濃度とともに増加することがわかりました。Cy3-TPシグナル減少の線形反応は、高アトロピン濃度で認められました（データは示さず、原稿準備中）。

結論

本報告では、ImageXpress Velosシステムレーザースキャニングプラットフォームを用いて、M1ムスカリン性アセチルコリン受容体を発現するCHO細胞へのCy3-TPのライブセルバインディングアッセイを実証しました。Cy3-TPの特異的結合、競合、置換を示すためにアトロピンを用いました。ホールウェルの画像は、統合された画像解析プログラムによって処理され、競合結合曲線、オンレート、オフレートの結果が生成されました。ROI内のセルカバレッジのウェル間差に起因するデータの質を改善するために、全細胞面積に正規化する簡単なワンステップ手順が示されました。ここで発表された結果は、ImageXpress Velosシステムが、マルチウェルプレート中のライブセル中のGPCRをスクリーニングするためのハイスループットプラットフォームの基盤を提供することを示しています。このプラットフォームのユニークな光学系とスキャニング・エンジンにより、シンプルな "プラグ・アンド・プレイ "アプリケーションが可能になり、以下のような要求に応えることができます。