Application Note 混入宿主細胞由来タンパク質測定法

はじめに

細胞培養または発酵中に宿主細胞によって産生される、目的の生物製剤以外のポリペプチド（「宿主細胞由来タンパク質」または「HCP」）は、100ppmという低いレベルで患者に免疫反応を引き起こす可能性があります1。治療用生物製剤の承認に先立ち、米国食品医薬品局（FDA）の "Points to Consider "2や欧州委員会の "Notes for Guidance "3,4に従って、製剤中の残留HCPのレベルを定量的に測定する必要があります。従って、HCPの除去は下流工程で実証されなければなりません2-6。

組換え生物製剤中の汚染HCPの存在をアッセイするための現在の分析物には、SDS-PAGE、イムノブロット法、ELISAがあります7-9。SDS-PAGE法とイムノブロッティング法は一般的に手間がかかり、主に定性的な結果が得られ、感度は高ppmの範囲です7。ELISA8,9を用いれば、より高い感度を得ることができるが、労力がかかり、精度が望まし くない場合があります。

このアプリケーションノートでは、特許取得済み抗HCP抗体の使用に基づき、例として大腸菌HCPとチャイニーズハムスター卵巣（CHO）HCPアッセイの性能データを示します。

材料

1. Threshold® System: Molecular Devices Corporation（カタログ番号0200-0500）、1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089、Tel: 408-747-1700 または 800-635-5577。
2. Immuno-Ligand Assay Labeling Kit：Molecular Devices Corporation製（カタログ番号R9002）。
3. Immuno-Ligand Assay Detection Kit: Molecular Devices Corporationより（カタログ番号R9003）。
4. 免疫原： 抗血清作製に使用するタンパク質混合物（免疫原）の選択は、ある製品に使用する特異性セルラインと精製プロセスを反映する必要があります10,11 。免疫原は一般に、産物の精製と同じ手順で精製するが、産物の遺伝子を持たない同等の細胞株とベクター（ヌル細胞）を用います。この模擬精製は同程度の規模であるべきで、理論上の産物純度が95%～99%になるように進めなければなりません。十分な量のHCPが、免疫原としての使用やその他の目的、例えば分析的 特性解析、イムノアフィニティークロマトグラフィー、アッセイスタンダードなどに必要となります。10 .
5. 抗体（免疫試薬）： 課題の一つは、免疫原として使用される複雑な混合タンパク質中の各抗原タンパク質に対して高い特異性と感度を有するポリクローナル抗体の作製です。動物の免疫応答は、強い抗原や主要な抗原だけでなく、弱い抗原やあまり優勢でない抗原に対しても刺激されなければなりません。これは、2つの方法のいずれか、またはそれらの組み合わせによって達成することができます。受動免疫12,14では、免疫原を以前の出血からの精製IgG（主要抗原を認識する）と混合し、動物に注射します。これにより、ブロックされた主要抗原に対する免疫原反応を減少させ、より弱い抗原に対するより強い免疫原反応を可能にします。カスケード免疫では13,14 。免疫アフィニティークロマトグラフィーでは、免疫原混合物から主要抗原を除去し、抗原性の低いタンパク質の濃度を濃縮するために、以前の出血から得られたIgGが使用されます。この調製物は、次のブーストで免疫原として使用されます。

抗体の特性解析

定量的な情報を得るための効率的なツールとして抗体を使用することに加えて、FDAは代替技術による抗体の特異性と抗HCP化学量論的特性の解析を要求しています。理想的には、1-Dまたは2-DのSDS-PAGEを銀染色して、対応するイムノブロットと同じタンパク質パターンを生成することです10,14。

方法

1. 抗HCP抗体の精製
   使用する抗体はプロテインAまたはプロテインGで精製します。より高い感度を得るために、抗体は抗原親和性精製することもできます8 。しかし、抗原親和性精製に関連する懸念事項として、カラムに不可逆的に結合する可能性のある非常に親和性の高い抗体の損失、カラムに結合しない非常に親和性の低い抗体の損失、カラムから溶出する際の抗体の変性が考えられます。
2. 抗体の標識と保存
   ポリクローナル抗 HCP 抗体のアリコートは、Threshold System Operator's Manual の ILA セクションに記載されている手順に従って、ビオチンまたはフルオレセインで標識します。長期保存の場合、標識抗体は分注し、-20℃で凍結保存します。しかしながら、抗体の全バッチを凍結する前に、凍結／融解サイクルが有害であるかどうかを判断するために、標識抗体の凍結した小分け液と凍結していない小分け液の性能を比較することをお勧めします。
3. アッセイ開発と最適化
   Threshold System Operator's ManualのILAセクションに記載されているように、抗HCPイムノリガンドアッセイを開発し、最適化することをお勧めします。ここでは、最適な標識抗体量（負荷試験）、標準曲線範囲、最適なインキュベーション時間と温度、検出限界を決定するためのプロトコールと手順が提案されています。

アプリケーション

Threshold Immuno-Ligand Assayを用いたHCPイムノアッセイは、哺乳類、細菌、酵母由来の様々な細胞株15に対して開発されています。感度とダイナミックレンジは抗体の品質に依存します。しかし、それらに共通する目標は、規制当局の 要件を満たすこと、すなわち、製品存在下での低濃度の宿主細胞 タンパク質を正確かつ再現性良く定量することです3,4。
以下のデータは、大腸菌およびCHO HCPイムノ・リガンド・アッセイから得られたものです。どちらのアッセイも、Threshold System Operator's ManualのILAセクションに記載されているプロトコールに従って、Thresholdのカスタマが開発したものです。簡単に説明すると、シーケンシャル・サンドイッチ・アッセイでは、抗原と標識抗体は最初の液相インキュベーションで複合体を形成し、ビオチンでコートされたニトロセルロース膜上でろ過捕捉されます。最適なインキュベーション時間は、特異性要件と抗体混合物の品質に依存し、アッセイごとに異なる場合があります。抗フルオレセイン：ウレアーゼコンジュゲート（酵素試薬）は、その後の緩慢な濾過工程でメンブレン上の複合体に結合します。このプロトコールには、検出抗体が免疫アフィニティー精製されていない場合に必要となる、より高濃度の抗体をインキュベーションに使用できるという利点があります。同時測定プロトコールは、酵素試薬とサンプルおよび抗体をインキュベートします。このプロトコールは Protein A または G のみで精製した抗体には適用できません。なぜなら、必要な蛍光標識抗体の濃度が抗フルオレセイン：ウレアーゼ結合体の量を超えてしまうからです（Threshold System Operator's Manual 参照）。

表 1 に大腸菌 ILA と CHOILA の一般的なアッセイパラメーターを示します。

測定精度

大腸菌HCPアッセイのアッセイ内精度を調べるため、1検体につき6反復をアッセイしました。日間再現性試験では、大腸菌 HCP アッセイでは 69 日間、CHO HCP アッセイでは 5 日間、サンプル測定を繰り返しました。

HCPアッセイ

考察

多抗原HCPイムノアッセイは、いくつかの理由から困難です。宿主細胞タンパク質の不均一性混合物を正確に分析することは困難です10。潜在的な混入タンパク質のスペクトルは、使用される特定の細胞株と特定の精製プロセスに大きく依存するため、最終バルク製品に潜在的に存在する抗原混合物を高感度、特異的、かつ化学量論的に認識するためには、特許取得済み抗HCP抗体が必要です。汎用の抗HCP抗体は、初期の精製ステップの最適化をサポートするためにのみ使用できる。精製工程を変更すると、潜在的な汚染タンパク質のスペクトルが変化する可能性があるため、アッセイとプロセス開発は密接に連携する必要があります。従って、免疫原選択点より上流での精製手順の変更は避けるべきである。その結果、アッセイ開発のタイミングを十分に考慮することが強く推奨されます。一般仕様のHCPアッセイは、第Ⅲ相臨床試験の開始前に実施することを目標としています16。

HCP測定法では、非常に複雑なタンパク質の混合物を標準物質として使用するため、標準物質 の保存中に各成分の安定性に差が生じると、長期的な再現性試験において矛盾が生じ る可能性があります。さらに、個々の宿主細胞タンパク質が表面に結合したり、アッセイ中に変性したりする可能性もあります。ILAの主な利点の一つとして、抗原と抗体は液相で結合することができ、そのため本来のコンフォメーションが維持されます。その結果、ELISAなどの固相結合システムと比較して、バックグラウンドシグナルが減少し、結合カイネティクスが向上します。

概要

本アプリケーションノートでは、HCPイムノリガンドアッセイ開発の一般的な側面と戦略について説明します。HCPコンタミナントアッセイは、免疫原や抗体の調製、アッセイ開発のタイミング、プロセスチームとアッセイ開発チームの調整などの点で、規制当局が要求する最も困難なアッセイである可能性があります。さらに、感度、精度、再現性に関して非常に厳しい要求があることも、難しさに拍車をかけている。液相結合反応、濾過中の特異性捕捉、および事前に適格化された試薬は、ILA形式がHCPアッセイの開発とバリデーションに極めて効果的かつ効率的であることを可能にする利点があります。

一例として、Thresholdの顧客が特許取得済みの精製プロセス特異性抗体を用いて開発した2つのアッセイが紹介されました。ダイナミックレンジは2 log、標識抗体は200 ng/test、インキュベーション時間は2-3時間で、対応するアッセイは非常に低いppm範囲での定量が可能です。日内および日間の精度は非常に良好で、C.V.sは10％未満でした。

大腸菌HCPおよびCHO HCPイムノ・リガンド・アッセイのデータを提供してくれたR.W. Johnson Pharmaceutical Research InstituteのDavid WongおよびIbrahim Ghobrial博士、ならびにThe Upjohn CompanyのMonica WhitmireおよびLeslie Eaton博士に深く感謝します。

参考文献

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3. 欧州委員会、バイオテクノロジー／薬学に関する特別作業部会、ガイダンス用ノート： 組換えDNA技術により製造された医薬品の製造と品質管理。1994年改訂版。
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