Application Note 3Dバイオプリント卵巣がんモデルの
イメージング特性評価

はじめに

Z. Baka, C. Godier, H. Alem | Institut Jean Lamour

R. Storm, M. Cattaneo, S. Tendil | モレキュラーデバイス

N. Chaboche, A. Nyamay’Antu | Polyplus Transfection

V. Gribova | INSERM

3Dバイオプリンティングとは、生物学的に機能的な3D構造体や人工組織モデルを構築するための、細胞と生物学的適合性材料の付加的成膜と定義されます *1。この技術は組織工学の分野に革命をもたらし、優れた再現性を確保しながら、複雑であらかじめ定義されたデザインの構造体を作成することを可能にしました。3Dバイオプリンティングに基づくアプローチは、軟骨 *2、骨 *3、皮膚再生など、さまざまな組織のエンジニアリングに応用されています *4。実際、2D細胞培養に基づくモデルは、その予測性の欠如からますます疑問視されるようになっており、3Dバイオプリンティングは、腫瘍微小環境（TME）をよりよくモデル化／表現するために、異なる種類の細胞や細胞外マトリックス由来の分子を沈着させることによって、この問題を回避する代替的なアプローチとして浮上しています。3Dバイオプリンティングに基づくがんモデルは、肺がん *5、乳がん *6、神経膠芽腫 *7など数多く報告されています。これらのモデルは、スフェロイドやオルガノイドなどの他の戦略と比較して、デザインの柔軟性や再現性において優位性を示しています。

3Dバイオプリンティングは、依然として卵巣がんモデルとしての研究が進行中であり、卵巣がんは重要な公衆衛生上の課題です。卵巣がんにおいては、がん関連線維芽細胞（CAF）ががん細胞と密接に相互作用し、がんの浸潤や薬剤耐性において主要な役割を果たすことが示されています *8,*9。したがって、卵巣がんモデルを設計する際には、CAFを重要な構成要素として考慮する必要があります。

このアプリケーションノートでは、3Dバイオプリンティングを用いて、がん細胞（SKOV3細胞）とCAFs線維芽細胞（MeWo細胞）からなる卵巣がんモデルを作製しました。SKOV3細胞はjetOPTIMUS®（Polyplus®）を用いてGFPプラスミドでトランスフェクトし、MeWo細胞はCellTracker™ Orange CMRA Dye（ThermoFisher）で染色しました。この2種類の細胞をゼラチン-アルギネートベースのハイドロゲルに含ませ、円柱状の腫瘍様構造体を作製するために使用する「bio-ink」を得ました。これらの腫瘍モデル内の細胞分布のホモジニアス性と再現性を、ImageXpress® Picoイメージングシステムを用いて評価しました。

結果と考察

図1に示すように、バイオプリント構造のイメージングから、GFPを発現するSKOV3細胞と蛍光染色したMeWo細胞がゼラチン-アルジネートベースのマトリックス内に均一性に分布していることが示されました（図1AおよびB）。バイオインク内でのホモジニアスな細胞分布は、3Dバイオプリンティングを実施する際に考慮すべき重要なパラメータであるため、このことは重要です *12。さらに、本来のTMEは、互いに密接に相互作用する複数の細胞種から構成されることが知られています *13。したがって、がん細胞と間質細胞との相互作用を促進するためにin vitro腫瘍モデルを構築する際に、この細胞近接性を再現することが極めて重要です。

腫瘍微小環境（TME）の多様性をより正確に再現するためには、複数の細胞種を組み合わせることが望ましいですが、再現性を確保するためには、各細胞種の総数およびそれぞれの比率を厳密に制御する必要があります。ImageXpress Picoは、迅速かつ容易に複数の顕微鏡画像を取り込むことができるため、このようなコントロールを行うのに特に適したシステムです。そのソフトウェアであるCell ReporterXpressは、Z stack最大投影法を用いて、厚いサンプルでも複数の細胞集団の定量を可能にします。このアプリケーションノートでは、このシステムを用いてバイオプリント腫瘍モデルを解析し、細胞数と割合の点で良好な再現性を示しました。検討した6つのバイオプリント構造体のうち、SKOV3細胞（細胞数FITC）の平均数は837±200（標準偏差≦25％）でした。MeWo細胞（細胞数TRITC）の平均数は3264.50±462（標準偏差≦15%）でした。

このアプリケーションノートでは、バイオプリント構造体において特定の遺伝子を迅速に可視化する方法を示します。バイオプリンティングによって3D構築物に組み込む前にトランスフェクションを行うことで、バイオプリンティング構造物の特定の細胞タイプにおいて一過性の遺伝子発現を達成することができます。これは、トランスフェクションが困難であることが知られているスフェロイドやオルガノイドのような他の3D細胞培養法と比べて、3Dバイオプリンティングの大きな利点です。この予備実験では、トランスフェクション効率は25％（STD 3.48％）と推定されました（図1D）。これは、例えば、ImageXpress Picoを使用して、複数の濃度のトランスフェクションミックス、DNAプラスミド量、タイミングをスクリーニングすることで改善できる可能性があります。このアプローチはまた、同じバイオプリント構造内で、間質細胞とがん細胞の両方で遺伝子サイレンシングや遺伝子編集を行う可能性をご提供します。

全体として、われわれはトランスフェクション、蛍光イメージング、細胞計数を組み合わせて、がん細胞とCAFを含む3Dバイオプリント卵巣腫瘍モデルの特徴づけと検証を行いました。細胞間相互作用に有利なマトリックス中で、2種類の細胞の再現性のある均質な分布とその近接性を示すことができました。このアプローチは、3Dモデルで観察される色素の浸透の制限なしに、制御された再現性のある細胞分布で、より複雑で完全な腫瘍モデルを作成する可能性をご提供します。したがって、3Dバイオプリント腫瘍モデルは、マイクロ流体システムに組み込む前に、その再現性を迅速に検証することができます。その後、生理的フロー下で長期培養することで、抗がん剤開発のための、より生体内に近い前臨床モデルを作成することができます。

材料と方法

ハイドロゲル調製

ハイドロゲル調製のために、必要な量のゼラチンおよびアルギン酸ナトリウム粉末を秤量し、紫外線で1時間除染した後、10％ウシ胎児血清を添加した最小必須培地（MEM）と混合したダルベッコ変法イーグル培地に溶解しました。得られた溶液を37℃で一晩、磁気攪拌下に保ち、完全にホモジナイズしました。

細胞のトランスフェクションと染色

SKOV3細胞はjetOPTIMUS（Polyplus）を用い、製造元の説明書に従ってGFPプラスミドでトランスフェクションしました *10。簡単に言うと、適量のDNAをjetOPTIMUSバッファーに希釈し、適量のjetOPTIMUSトランスフェクション試薬を加えました。トランスフェクション溶液を室温で10分間保持した後、T75フラスコで60～80％コンフルエントに培養したSKOV3細胞に添加しました。

MeWO細胞は、製造元（ThermoFisher）のプロトコルに従い、CellTracker Orange CMRA Dyeで染色しました。簡単に言うと、色素をDMSOに溶解して作業用溶液を調製し、それをMEM培地で希釈しました。細胞は37℃で30分間インキュベートされました。その後、試薬溶液を除去し、新しい完全培地に置換しました。

細胞のカプセル化

bio-inkの調製では、トリプシン処理した細胞を新鮮な培養液に懸濁し、先に調製したポリマー溶液に慎重に加えました。得られた懸濁液をゆっくりと撹拌し、バイオインク内の細胞分布を均質化しました。

バイオプリンティングプロセス

調製したbio-inkを3mLのカートリッジに充填し、バイオプリンティングヘッドに装填しました。バイオプリンティングは24ウェルプレートで行われました。各3mLカートリッジは約48個の構造をバイオプリントしました。バイオプリント後、構造体は100mM CaCl₂溶液を用いて架橋され、新鮮な培養液で補充され、実験に必要なまで37℃、5％CO₂で培養されました。

細胞イメージング

バイオプリントした構造体を96ウェルプレート（Greiner 、ガラス底、黒壁）に移しました。

細胞はImageXpress Pico 自動細胞イメージングシステムで4X対物レンズを使用して画像化しました。

画像は、透過光、FITCおよびTRITCチャンネルを用い、それぞれ5、150および250msの露光時間で、ウェルあたり1部位ずつ取得しました。4倍の対物レンズでウェル全体の約40％の領域を表示。ハードウェアベースのオートフォーカスと画像ベースのオートフォーカスを組み合わせて、50µm間隔で7つのZ平面を取得しました（Z stacking）。最大2D投影画像はオンザフライで生成されました。

FITC または TRITC チャンネルにシグナルを持つ細胞を定量するために、Cell ReporterXpress™ ソフトウェアの設定済み細胞数解析モジュールを使用しました。解析に使用したセグメンテーション・パラメーターは、強度、最小幅、最大幅でした。値はFITCチャンネルでは23, 7, 100、TRITCチャンネルでは23, 7, 38でした。

謝辞

Pascal Kessler - フランス、ストラスブールのCRBS PIC-STRAの顕微鏡プラットフォーム。

参考文献

1. Tan B, Gan S, Wang X, Liu W, Li X. Applications of 3D bioprinting in tissue engineering: advantages, deficiencies, improvements, and future perspectives. J Mater Chem B. 2021;9(27):5385–5413. doi:10.1039/D1TB00172H
2. Nguyen LH, Kudva AK, Saxena NS, Roy K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 2011;32(29):6946–6952. doi:10.1016/j. biomaterials.2011.06.014
3. Kang HW, Lee SJ, Ko IK, Kengla C, Yoo JJ, Atala A. A 3D bioprinting system to produce human scale tissue constructs with structural integrity. Nat Biotechnol. 2016;34(3):312–319. doi:10.1038/nbt.3413
4. Cubo N, Garcia M, Cañizo JF del, Velasco D, Jorcano JL. 3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis. Biofabrication. 2016;9(1):015006. doi:10.1088/1758-5090/9/1/015006
5. Wang X, Zhang X, Dai X, et al. Tumor-like lung cancer model based on 3D bioprinting. 3 Biotech. 2018;8(12). doi:10.1007/s13205-018-1519-1
6. Swaminathan S, Hamid Q, Sun W, Clyne AM. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 2019;11(2):025003. doi:10.1088/1758-5090/aafc49
7. Wang X, Li X, Ding J, et al. 3D bioprinted glioma microenvironment for glioma vascularization. J Biomed Mater Res B. Published online 2020. doi:10.1002/jbm.a.37082
8. Ji Z, Tian W, Gao W, Zang R, Wang H, Yang G. Cancer-Associated Fibroblast-Derived Interleukin-8 Promotes Ovarian Cancer Cell Stemness and Malignancy Through the Notch3-Mediated Signaling. Front Cell Dev Biol. 2021;9:684505. doi:10.3389/fcell.2021.684505
9. Yan H, Guo BY, Zhang S. Cancer-associated fibroblasts attenuate Cisplatin-induced apoptosis in ovarian cancer cells by promoting STAT3 signaling. Biochem Biophysl ResCommun. 2016;470(4): 947–954. doi:10.1016/j.bbrc.2016.01.131
10. jetOPTIMUS® DNA Transfection Reagent. Accessed June 9, 2022. (account creation required) https://myaccount.polyplus-transfection.com/my-account-home/protocol-download/
11. CellTrackerTM Orange CMRA Dye. Accessed June 8, 2022. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C34551
12. Bhattacharyya A, Janarthanan G, Tran HN, Ham HJ, Yoon J, Noh I. Bioink homogeneity control during 3D bioprinting of multicomponent micro/nanocomposite hydrogel for even tissue regeneration using novel twin screw extrusion system. Chem Eng J. 2021;415:128971. doi:10.1016/j.cej.2021.128971
13. Anderson NM, Simon MC. The tumor microenvironment. Curr Biol. 2020;30(16):R921–R925. doi:10.1016/j.cub.2020.06.081

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