Application Note SpectraMaxマルチモードマイクロプレートリーダーでの
IMAPホスホジエステラーゼアッセイ

はじめに

モレキュラーデバイスのIMAP® テクノロジーは、キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼの迅速、ホモジニアス、非放射性アッセイを可能にし、アッセイ開発とハイスループットスクリーニングの両方に適しています。IMAPアッセイは、ナノ粒子上に固定化された金属配位錯体へのリン酸の結合に基づきます。IMAP結合体がリン酸化基質に結合すると、ペプチドの分子運動が変化し、ペプチドに結合した蛍光標識の蛍光偏光（FP）が増加します（図1左）。このアッセイのTR-FRETバージョンでは、テルビウム（Tb）ドナーが含まれるため、リン酸化基質が存在すると蛍光エネルギー移動が起こります（図1、右）。このアッセイは時間分解モードで検出されるため、アッセイ成分やスクリーニング中の化合物による蛍光干渉がほとんどないです。TR-FRETは、基質のサイズや濃度にも柔軟に対応できます。

環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（PDEs）は、様々な生物学的プロセスに関与するセカンドメッセンジャーであるcAMPとcGMPのホスホジエステル結合を分解する酵素群です。PDEsは、心臓病、認知症、うつ病などの領域で臨床的に重要であるため、薬剤の標的として重要なクラスとして浮上してきました。このアプリケーションでは、SpectraMax®i3、SpectraMax®Paradigm®、SpectraMax®M5、およびFlexStation®3マルチモードマイクロプレートリーダーとSoftMax®Proソフトウェアを使用したIMAPテクノロジーによるPDE酵素希釈および阻害曲線の測定方法をご紹介します。

材料

• IMAP FP PDE Evaluation Assay Kit（モレキュラーデバイス P/N R8175）
• IMAP TR-FRET PDE Evaluation Assay Kit（モレキュラーデバイス P/N R8176）
  ◦IMAPプログレッシブ結合試薬
  ◦IMAPプログレッシブバインディングバッファーA (5X)
  ◦IMAP Progressive Binding Buffer B（5X）
  ◦TR-FRET Tbドナー
  ◦0.01%Tween-20含有IMAP反応バッファー（5X）
  ◦フルオレセイン標識cGMP PDE基質（モレキュラーデバイス P/N R7507）
• ウシ脳由来ホスホジエステラーゼ1、3'、5'-サイクリックヌクレオチド特異性 (Sigma)
• カルモジュリン（Sigma）
• 塩化カルシウム（主要実験室供給業者）
• DL-ジチオスレイトール（DTT）（主要な実験室供給業者）
• 384ウェルポリスチレン黒（FP用）および白（TR-FRET用）マイクロプレート（例：Corning）

方法

酵素希釈シリーズ

完全反応バッファー（CRB）は1mM DTT、2500U/mLカルモジュリン、2.5mM CaCl2で調製しました。フルオレセイン標識cGMP基質をCRBで希釈し、200nM（2X）の作業濃度としました。最適な基質濃度およびその他のアッセイパラメーターは以前に決定しました（IMAP Assay Archive）。0.002U/mLから始まるPDE1酵素の1:3希釈系列をCRBで2倍作業希釈液として調製しました。酵素反応は、黒色（FP）または白色（TR-FRET）の384ウェルプレートに、ウェルあたり20μLの容量で4重複製し、以下の添加を行いました：

• 2X 酵素希釈液または酵素なし（CRB）10μL
• 10μLの2X基質溶液

緩衝液のみのコントロールでは、20μLのCRBをウェルに添加しました。アッセイは室温で1時間インキュベートしました。

阻害剤アッセイ

PDE1阻害剤8-MM-IBMXおよびザプリナストを、4倍の作用濃度でCRBに連続希釈しました。両シリーズとも200μM（最終濃度）から開始し、1:3に希釈しました。EC₈₀濃度1.3 x 10-4U/mLのPDE1酵素を4倍作用溶液として調製しました。反応は以下のように組み立てました：

• コントロール用の4X阻害剤またはCRB 5 μL
• 4X 酵素 5 μL
• 2X 基質溶液 10 μL

結合反応

各検出モードに特異的なIMAP結合液が調製されました。FPの場合、バッファーA 75%、バッファーB 25%、および1:600の結合試薬が封じ込められました。TR-FRET用には、60% Buffer A、40% Buffer B、1:800 Binding Reagent、および1:400 Tb Donorが含まれました。バッファーのみのコントロールには、結合液から Tb ドナーを除いたものを用いました。60μLの適切なBinding Solutionを各アッセイウェルに加え、1時間（FP）または一晩（TR-FRET）インキュベートしました。

検出

結合ステップの終了後、アッセイプレートをSpectraMax i3およびSpectraMax Paradigmプレートリーダーで表1の設定を用いて読み取りました。すべてのデータは、SoftMax Proソフトウェアを使用して取得および解析しました。各アッセイに最適な設定と解析パラメーターを封じ込めたソフトウェアプロトコルは、結果の計算を簡略化するために事前に設定したものを使用しました。各アッセイに最適な読み取り高さを確保するため、プレートを読み取る前にRead Height Adjustment手順を実行しました。

*SoftMax Proソフトウェアでのこのプレート定義は、白黒プレートでも同じです。

表1. IMAP PDE アッセイ用の SpectraMax i3 プレートリーダー設定。

結果

酵素希釈系列を実施することで、酵素とアッセイの性能が検証され、阻害剤スクリーニングアッセイに使用される酵素のEC₈₀濃度を計算することができます。FPおよびTR-FRETアッセイモードの両方で、IMAPテクノロジーを用いてPDE1酵素希釈系列を実施しました。EC₅₀ 値は、両方のアッセイタイプで非常によく一致し（図 2）、以前に発表された値と同様でした。陽性対照と陰性対照から計算されたZ' factorは、各アッセイで0.9以上であり、ハイスループットスクリーニングに適した頑健な性能を示しました。阻害剤アッセイでは、FPとTR-FRETアッセイの両方の出力で同様のIC₅₀値が得られました（図3）。

結論

IMAPテクノロジーは、キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼをスクリーニングするための均一性、非抗体ベースのプラットフォームをご提供します。安定性とロバスト性があり、小型化が可能で、優れたZ' factor値を持つ高品質のデータが得られるため、阻害剤のスクリーニングに適しています。他のいくつかの方法とは異なり、IMAPはより適切な結果を得るために直接結合を測定します。IMAP TR-FRETアッセイでは、直接Kmを決定することも可能です。

IMAPアッセイは次ページのシステムで実施できます。ここに示したデータは SpectraMax i3 プレートリーダーで得られたものです。SpectraMax Paradigmプレートリーダーでも同様の結果が得られており、高速デュアルPMT検出という利点もあります。あらかじめ設定されたアッセイプロトコルを備えた SoftMax Pro ソフトウェアは、データ収集から解析までのワークフローを簡素化します。モレキュラーデバイスは、120種類以上の酵素、検証済みのプロトコール、キット、基質2に関するリファレンスデータを含むIMAP Assay Archiveを含む、完全なIMAPスクリーニングソリューションをご提供しています。

参考文献

1. Ahn, HS, Bercovici, A, Boykow, G, et al. (1997). Potent tetracyclic guanine inhibitors of PDE1 and PDE5 cyclic guanosine monophosphate phosphodiesterases with oral antihypertensive activity. J. Med Chem. 40, 2196-2210.
2. IMAP Assay Archive　http://support.moleculardevices.com/assayarchive/index.html.

以下のモレキュラーデバイスシステムと互換性があります。

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