Application Note インターレースリーディングによる
アルファアッセイのクロストークの改善

はじめに

テレサ・カスターニョ・マルティネス博士｜フィールドアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

RevvityのAlphaScreen®とAlphaLISA®アッセイを含むAlphaテクノロジーは、目的の生体分子に結合したドナービーズとアクセプタービーズを使用するビーズベースのテクノロジーです。生体分子が相互作用すると、ビーズは近接し、マイクロプレートリーダーを使用して測定される化学発光シグナルを生成するためのエネルギー移動を可能にします。アルファテクノロジは分子間相互作用の研究に一般的に使用されており、（1）小型化、（2）高いSB比、（3）ホモジニアスなアッセイフォーマット、（4）マルチプレックスが可能、といった利点があり、これらすべてがこの技術をハイスループットなアッセイに適しています。しかし、非常に明るいシグナルを発生するため、ウェル間のクロストークが増加する可能性があります。

したがって、適切なマイクロプレートリーダーの選択と実験デザインは、クロストークを減少させ、データの質を向上させる可能性があります。 このテクニカルノートでは、SoftMax® Proデータ収集・解析ソフトウェアのInterlaced Reading機能を使用してAlphaアッセイのクロストークを減少させる利点に焦点を当てます。これらのアッセイは、AlphaScreenカートリッジとともにSpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーで実行されます。

Molecular Devices Alphaアッセイ - 対応マイクロプレートリーダー

AlphaScreenおよびAlphaLISAのシグナルは、SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダーおよびSpectraMax Paradigm マルチモードマイクロプレートリーダーで、以下の検出カートリッジのいずれかと一緒に読み取ることができます：

• AlphaScreen 384 Std 検出カートリッジ
• AlphaScreen 384 HTS検出カートリッジ
• AlphaScreen 1536 HTS検出カートリッジ

検出カートリッジの選択は、プレートフォーマットと希望するスループットによって異なります。以下の表では、推奨カートリッジが示されています。選択は、プレートフォーマットと標準的なスループットによって異なります。

全てのAlphaScreen検出カートリッジはアルファアッセイの高感度検出のためにレーザーダイオードを使用しています。さらに、カートリッジは最適化されたデザインで、検出中、各ウェルを分離し、クロストークを減少させ、アルファアッセイに最適なパフォーマンスを可能にします。

表1. 3種類のAlphaScreenカートリッジに対応するプレートフォーマットと読み取り時間。

https://moleculardevices.com/sites/default/files/en/assets/data-sheets/br/spectramax-paradigm-cartridge-alphascreen-detection-cartridges.pdf

リーダーセットアップの推奨

すべてのMolecular DevicesマイクロプレートリーダーはSoftMax Proソフトウェアで制御されるため、リーダー間および共同研究者間の一貫性が保たれます。Alphaアッセイでは、以下のインストゥルメンテーション設定を推奨します：

表 2. SpectraMax i3xリーダーでのAlphaScreenアッセイに推奨されるインストゥルメンテーション設定。AlphaScreen 384 HTS "と呼ばれる設定済みプロトコールは、プロトコールライ ブラリにあります。

クロストークとは何ですか？

クロストークとは、マイクロプレートの1つのウェルで発生したシグナルがそのウェルに限定されず、隣接するウェルのシグナルと干渉することで起こる現象です。アルファアッセイでは減衰時間が長いため、このような望ましくない影響がよく見られます。

 減衰時間が長いためです。ウェルが励起されると、アルファ信号の減衰時間は非常に長くなり、発光はそのウェルの読み取り時間よりも長くなることがあります。

そのため、検出器が次のウェルに移動する際、測定されたばかりの隣接ウェルはまだ発光しています。その結果、2つ目のウェルで測定された光は、1つ目のウェルからの光で「汚染」され、一般にクロストークと呼ばれる現象が発生します。

SoftMax Proソフトウェアを搭載したSpectraMax i3xリーダーの利点の1つは、Interlaced Readingオプションを使用してクロストークを低減できることです（図1）。チェス盤のパターンに似ていますが、インストゥルメンテーションは、隣接するウェルを連続して読み取るのではなく（A1、A2、A3）、2つ目のウェルごとに読み取ります（A1、A3、A5...）。インストゥルメンテーションはマイクロプレートの1つおきのウェルを読み取り、その後、読み飛ばしたウェル（A2、A4、A6...）を読みに戻ります。この読み取りパターンにより 標準曲線（図2）で示されるように、データの質が向上し、特に低濃度での%CV値が低下します（表3）。クロストークは、最も近い空のウェルと最も高い標準サンプルを比較することで計算されました。このデータは、Interlaced Readingを使用して測定した場合、クロストークが74倍減少したことを示しています（図3）。

表3. 低濃度サンプル（0.032 mg/ml）をインターレース設定ONで読み取った場合とインターレース設定OFFで読み取った場合の平均カウントと%CV値を示す比較表。

結論

これらの結果をまとめると、SpectraMax i3xおよびParadigmリーダーとSoftMax Proソフトウェアで利用可能なインターレース読み取りオプションを使用すると、AlphaScreenおよびAlphaLISAアッセイでクロストークを大幅に削減できることが実証されました。さらに、標準曲線の下部におけるCV%の減少は、データの忠実性に有益な効果をもたらし、研究者は低濃度の被験分子をより正確に検出できる可能性があります。