Application Note 近赤外ラベルと高度な画像・データ解析技術で
セルペインティングの精度と信頼性がさらに向上

近赤外ラベルを用いたセルペインティングアッセイの感度が向上
IN Cartaのディープラーニングモジュール『SINAP』で信頼性の高い画像セグメンテーションを実現
StratoMineRで使いやすいクラウドベースのデータ分析

PDF版（英語）

はじめに

セルペインティングアッセイに代表される画像ベースの表現型プロファイリング手法は、ハイコンテントイメージングと多パラメータの解析を組み合わせることで、細胞における生物学的・遺伝的・化学的な撹乱の影響を評価するために広く用いられています。この方法は、創薬プログラムからゲノムのスクリーニング研究まで、幅広いアプリケーションで使用されています。

標準的なセルペインティングアッセイでは、さまざまな細胞小器官や構造（核、細胞質、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、細胞骨格、cytoRNA、核小体）が5つのイメージングチャンネルに取り込まれます。このように細胞を広範囲に染色することで、複数の形態学的変化をシングルセルの分解能でモニターし、定量化することができます。発表されたセルペインティングアッセイの限界としては、適切な色素の入手が困難であることと、イメージングシステムが適切なスペクトル分離を行うことができないことが挙げられます。特異性として、ゴルジ体とアクチンは同じイメージングチャンネルを用いてイメージングされるため、画像解析中に2つの構造を分離する際に困難が生じます。この制限は、ヒット化合物の選択を妨げたり、特にゴルジ体（生合成経路）や細胞骨格ネットワークに影響を及ぼす作用機序（MOA）を持つ化合物の効果を覆い隠したりする可能性があります。

ここでは、近赤外光源を搭載したImageXpress® Confocal HT.aiハイコンテントイメージングシステムを活用することで、アッセイを改善することを試みました。私達は、Alexa Fluor 568ファロイジンをAlexa Fluor 750ファロイジンに交換し、細胞骨格をゴルジ区画から明確に分離できるようにしました。

このマルチプレックスアッセイは複雑であるため、これらの画像の解析から生成されるデータ量が膨大になり、データのマイニングと解釈を支援する追加の分析物が必要となります。管理しやすい画像とデータ解析のために、特徴抽出にはIN Carta®画像解析ソフトウェアを使用し、データマイニングと解析にはHC StratoMineR™を使用しました。IN Cartaには、よりロバスト性の高い特徴セグメンテーションを可能にするディープラーニング機能が搭載されています。したがって、セルペインティングアッセイは、ディープラーニングSINAPモジュールと併用することで、核の検出が向上するというメリットがあります。さらに、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、細胞骨格などの細胞小器官は、必要に応じてディープラーニング機能を使ってさらにセグメンテーションすることができます。蛍光強度、空間数、テクスチャー、オルガネラの分布、コロケーションの測定値を含む測定値を、解析画像から抽出することができます。データはその後、さらなるデータ解析のために、直感的なクラウドベースのデータ解析プラットフォームであるHC StratoMineRにアップロードされます。私達のアプローチが標準的なセルペインティング・プロトコルに比べて優れているかどうかを調べるため、5チャンネルで取得した画像と6チャンネルで取得した画像の表現型距離スコアを比較しました。その結果、化合物のサブセットで処理した細胞では、距離スコアが最大49％増加しました。これらの結果は、ゴルジ体と細胞骨格に別々のイメージングチャンネルを使用することで、セルペインティングアッセイの感度が向上し、多様な細胞表現型プロファイルをよりロバスト性高く表現できることを示しています。

方法

U2OS細胞（ATCC）を1ウェルあたり2000細胞播種しました。
11種類の化合物を7点1：3希釈系列で、適切なコントロールとともに4重ウェルでテストしました。使用した化合物 Ca-074-Me、CCCP、クロロキン、サイトカラシンD、エトポシド、ラトルンクリンB、ラパマイシン、ロテノン、スタウロスポリン、パクリタキセル、テトランドリン。
細胞はBrayら1によるプロトコルを用いて染色しました。修正プロトコールでは、phalloidin/Alexa Fluor 568の代わりにphalloidin/Alexa Fluor Plus 750（Thermo Fisher）を用いました。
画像取得は、ImageXpress Confocal HT.ai（レーザーベース）またはImageXpress Micro Confocal（LEDベース）ハイコンテントイメージングシステム（モレキュラーデバイス）のいずれかで、20X Plan Apo対物レンズを用いて行いました。使用したフィルターは表1に示します。
画像解析にはIN Carta画像解析ソフトウェアを使用した。選択された測定値には、強度、テクスチャー、形状、空間関係、および共局在化スコアに関するパラメータが含まれます。
セルレベルのデータは、StratoMineR™（https://cla.stratominer.com/index.php, Core Life Analytics）にアップロードし、さらなるデータ解析を行いました。簡単に説明しますと、品質管理、プレーティングの正規化、データの形質転換、特徴の標準化が適用されました。主成分分析（PCA）は、データセットの次元を下げるために使用されました。さらに、主成分と表現型の距離スコアに基づいて、ヒット選択とクラスタリング解析などの下流解析を行いました。

画像ベースプロファイリングのワークフローの概要。上記の各ステップの詳細。

結果

画像取得

セルペインティングアッセイでは、6種類の蛍光マーカーを用いて同時に細胞を標識し、様々な細胞構造をイメージングします。ゴルジ装置（AGPチャンネル）と細胞骨格は、同じフィルターセットを用いて撮像されます（表1、図1）。これらの細胞内構造の解像度は、通常、画像解析の段階で行われます。私達のモデルアッセイでは、U2OS細胞を11種類の化合物で24時間処理した後、既報のプロトコールに従って処理しました。

ゴルジ構造と細胞骨格を分離するために、Alexa Fluor 568 PhalloidinをAlexa Fluor 750 Phalloidinに置き換えてアッセイを修正し、NIR光源を備えたImageXpress Confocal HT.aiハイコンテントイメージングシステムを用いて細胞をイメージングしました（図2A）（以下、修正アッセイと呼びます）。この方法により、未処理細胞ではゴルジ体構造が核周辺に分布していることが明瞭に確認できます。この分布は、WGA（ゴルジ体）染色とファロイジン（アクチン）染色の両方を同じチャンネルでイメージングした場合には、容易に区別できないです（図1）。この違いは、化合物（テトランドリンなど）で処理した細胞ではより明らかです（図2B）。

図1. セルペインティングアッセイ。既発表のプロトコルを用いてセルペインティングアッセイ用の色素で染色した細胞の例。ゴルジ体とアクチン構造は同じチャンネル（AGP）で取得されていることにご注意。アクチンの染色は糸状構造で表されます。しかし、ゴルジ体は目視では容易に区別できません。

セルコンパートメント	染料	Ex/Em	使用フィルター（LED	使用フィルター（レーザー）
核（DNA）	Hoechst 3342	350/461	DAPI 377/447	DAPI 405/452
小胞体（ER）	コンカナバリン A - AlexaFluor488 コンジュゲート	495/519	FITC 475/536	FITC 467.5/520
核小体（RNA）	SYTO14	516/549 (DNA) 521/547 (RNA)	Cy3 531/593	YFP 520/562
ゴルジ装置（AGP）	小麦胚芽アグルチニン AlexaFluor555コンジュゲート	555/565	Texas Red 560/624	TRITC 555/598
F-アクチン（AGP)	ファロイジン AlexaFluor568	578/600	Texas Red 560/624
F-アクチンファロイジン	AlexaFluor750	758/784		Cy7 725/794
ミトコンドリア（mito）	MitoTracker Deep Red	644/665	Cy5 631/692	Cy5 638/692

表1. セルペインティングアッセイで使用した染色と、細胞コンパートメントの検出に使用したフィルターセット。

図2. セルペインティングアッセイの変更セルペインティングアッセイのスペクトル分離を改善するために、遠赤色光源を用いたプロトコルを変更しました。A) 修正プロトコールでは、アクチンの標識にファロイジンAlexa Fluor 750を用いました。コントロールウェルの画像例を示します。インセット（白枠）は拡大し、核（青色）とゴルジ体（黄色）チャンネルを合成して示しました。ゴルジ体の点刻が、主に核周辺に分布しているのが明瞭に認められます。B) テトランドリンで処理した細胞のイメージング。左はアクチンとゴルジチャンネルを統合した再構成画像（黄色）。右はゴルジ体（黄色）と核（青色）のみの画像。ゴルジ体分布に対するテトランドリンの影響は、修正したプロトコール（右）の方がより明確です。C) レーザー光源とその相対出力。それぞれの光源による細胞コンパートメントの検出。

特徴抽出とデータ解析

標準セルペイント色素セットで染色した細胞と、改良色素セットで染色した細胞との違いを定量化するために、IN Carta画像解析ソフトウェアで画像を解析しました（図3）。抽出された測定値は、さらなるデータ解析のためにHC StratoMineRにアップロードされました。主成分分析(PCA)は、標準的なセルペインティングアッセイと改良アッセイから抽出されたデータに対して行われました。興味深いことに、AGP チャンネルからの測定値は、5 チャンネル画像から得られた PCA 1 の特徴成分のほとんどを占めていました。しかし、アクチンチャンネルからの測定値は、修正された6チャンネル画像からのPCA1では、支配的な特徴のほとんどを占めています（図4）。このことは、修正アッセイが、MOAの理解に有用なアクチンとゴルジ体成分間の表現型プロファイルの解像度を改善できることを示唆しています。

また、標準アッセイと改良セルペインティングアッセイの表現型プロファイルを、それぞれの距離スコアに基づいて比較しました。このスコアは、陰性対照との表現型的な距離を示すもので、スクリーニングアッセイにおけるヒットセレクションに用いることができます。ゴルジ体経路に影響を及ぼすことが知られている化合物では、距離スコアが増加することがわかりました（表2）。これらの結果は、ゴルジ体と細胞骨格に別々のイメージングチャンネルを使用することで、セルペインティングアッセイの感度が向上し、細胞の表現型プロファイルをよりロバスト性高く表現できることを示しています。

図3. 様々な細胞構造をセグメンテーションするために、IN Cartaソフトウェアで特徴抽出を行いました。ここでは、すべての処理において核のロバスト性セグメンテーションを達成するために、内蔵の核モデルを使用しました。6チャンネルで取得された画像について、細胞あたり487の特徴が抽出されました。IN Cartaソフトウェアで特徴マスクをオーバーレイした画像例です。

図4. データ解析のためのHC StratoMineRを使用。A) HC StratoMineRは、ハイコンテントマルチパラメトリックデータの解析における典型的なワークフローをユーザーにガイドするウェブベースのプラットフォームです。B) PCA（一般化重み付き最小二乗法）を用いて、データを15成分に絞り込みました。PCA1へのフィーチャー寄与を偏光プロットで示します。細胞コンパートメントによって色分けされています。5チャンネル（上）と6チャンネル（下）のセルペインティング撮影によるPCA1フィーチャー。フィーチャー寄与の違いにご注意。

化合物	距離スコアの変化(%)
クロルキン	49
テトランドリン	48
CCCP	11

表2. セルペインティングの5チャンネルと6チャンネルのデータセット間の距離スコアの変化

結論

我々の結果は、近赤外レーザーの使用によりセルペインティングアッセイの感度が向上したことを示すものです。この場合、ゴルジ体表現型の分離においてより感度の高いアッセイの開発が可能となりました。
また、チャンネルを追加することで、プロジェクト特有のバイオマーカーを追加し、標準的なセルペインティングアッセイを拡張することができます。

参考文献

Bray MA et.al., Nat Protoc. 2016 Sep;11(9):1757-74
Gustafsdottir SM et.al., PLoS One. 2013 Dec 2;8(12):e80999.
Omta WA, et.al., Assay Drug Dev Technol. 2016 Oct;14(8):439-452

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