Application Note マイクロ流体システム、磁性ナノ粒子、
ハイコンテントイメージャーを用いたin vitro 3Dがんアッセイ

はじめに

Oksana Sirenko, PhD | Applications Scientist | モレキュラーデバイス
Matthew Hammer | Applications Scientist | モレキュラーデバイス

近年、研究や医薬品開発のために生理学的に正確な3D細胞モデルを持つ必要性が着実に高まっています。研究者たちは、疾患と正常な生理学の両方を理解するために、様々な3D細胞モデルの形成と維持を完成させてきました(*1,*2)。複雑なアッセイを、貴重なサンプル、特に患者由来の材料で、簡単かつ迅速に実行する能力が、いくつかの制限要因となってきました。スフェロイドやオルガノイドの手作業による処理、染色、加工は一般的に手間がかかり、サンプルの破壊や紛失が起こりやすいです。さらに、オルガノイドはウェルの端に配置される傾向があり、あるいはウェル内の異なる位置や高さに配置されることがあるため、ハイコンテントイメージングは困難な場合があります。また、マルチウェルプレートで薬物治療やアッセイを行う場合、1サンプルあたりの読み出し回数が制限されます。

このプロセスを合理化し、容易にする新技術が急速に開発されつつあります。私たちは、マイクロフルイディクスシステムPu-MAシステム® 3D MAGと3Dフローチップ（Protein Fluidics社製）を用いて、磁性コーティングされた3D細胞モデルを用いた自動アッセイステップを実施（図1）。磁性ナノ粒子NanoShuttle™(3)でコーティングされた3D細胞モデルは、埋め込まれた磁石を用いてフローチップのウェルに移され、センタリング。自動マイクロ流体システムにより、培地交換、化合物添加、微小組織の処理が自動化。次に、ImageXpress® Micro Confocalハイコンテントイメージングシステム（モレキュラーデバイス）を用いて、スフェロイドやオルガノイドの形態や化合物の効果を特徴づけ、定量化する高度な解析とともに、3D構造解析を効率的に行いました。

2つの複雑な3Dアッセイの自動ワークフローを実演：

• 3D癌スフェロイドの薬剤処理、染色、解析： HeLaスフェロイドを化合物で24～48時間処理。自動化された生存率染色を用いて、化合物処理の濃度応答曲線を決定。
• 薬剤感受性の評価とバイオマーカーの免疫蛍光分析： トリプルネガティブ乳がん（TNBC）患者由来オルガノイド（PDO）(4)の薬剤感受性を評価。PDOをIFマーカーで染色し、フローチップで画像化。

Pu-MAシステムと3D MAGのワークフロー

Pu-MAシステムと3Dフローチップは、自動化されたオルガノイドアッセイを合理化するために設計。Pu-MAシステム3D MAGは、標準的なPu-MAシステムデバイスに3D MAGの改良を加えたもので、アッセイステップ中、保護されたサンプルチャンバー内に磁気コーティングされた3D細胞モデルを保持することができます（図1および2）。

3DスフェロイドのNanoShuttle処理はGreiner Bio-Oneのプロトコールに従って行われました(*3)。ここでは、このバイオプリンティングプロセスと我々の自動アッセイシステムを組み合わせた新しい利用法を示します。

磁化された3D細胞モデルは、磁性ナノ粒子でコーティングされたオルガノイドのセンタリングと保持を確実にする小型（φ1mm～）磁性ロッドを封じ込めたローディングトレイを使って、フローチップに移されました（図2）。その後、フローチップをインキュベーター内のシステムに入れます。Pu-MAシステムのシステム構成と、流体の移動に空気圧を使用することで、インキュベーター環境内のサンプルチャンバーにガス交換が行われます。

フローチップは、マルチチャンネルや自動液体分注システムに適合する便利なマルチウェルプレートフォーマット（384ウェル間隔 SLAS/ANSI標準）で設計されています。底面は光学的に透明で、蛍光イメージングや共焦点イメージングシステムでのイメージングが可能です（図1）。これは、アッセイ全体を通して磁気コーティングされた3Dモデルの位置を中央に維持する機能とともに、すべてのサンプルウェルで同じ3D画像取得フィールドを自動化することを容易にします。さらに、ImageXpress® Micro Confocalシステムのロバスト性オートフォーカス機能は、各サンプルウェル内のスフェロイドまたはオルガノイド全体の高解像度画像の取得に役立ちます。

3Dがんスフェロイドの薬剤処理、染色、イメージング

マイクロ流体サンプル処理と磁気ビーズを用いたワークフローの応用は、HeLaスフェロイドを用いて、選択した細胞毒性薬剤処理の効果に対する細胞生存率と細胞死について実証(*5)。HeLa細胞は、Greiner Bio-One(*3)のプロトコールに従って、撥細胞性表面の384ウェルマイクロプレートに2,000個/ウェルで磁気バイオプリントされました。NanoShuttleでコートしたHeLa細胞を37℃、5% CO₂で1時間、磁気ホールドドライブの上でインキュベート。その後、形成されたスフェロイドをフローチップウェルにプレーティングし、Pu-MA System 3D MAGを用いて処理する前に、プレートをインキュベーター内に1日放置しました。

以下の例では、HeLa 3Dスフェロイドを異なる化合物濃度（スタウロスポリン、0～10μM）で22時間自動処理した後、培地を染色液に交換して2時間インキュベートし（カルセインAM、ヘキスト、エチジウムホモダイマー1）、サンプルをPBSで洗浄しました。

処理工程の後、フローチップを装置から取り出し、ImageXpress® Micro Confocal イメージングシステムを用いてフローチップ内の画像を撮影。画像は10Xまたは20X対物レンズを用い、510μm間隔で12～20枚の3D Z-stackで取得し、MetaXpress®ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアのシンプルなカスタムモジュールを用いて2Dプロジェクション画像を解析し、細胞生存能を迅速に定量化しました（図3）。MetaXpress®ソフトウェアを用いて、スタウロスポリン処理時の全生細胞数または死細胞数を定量。ライブデッド解析アプリケーションモジュールは、2Dプロジェクション画像（最大投影）またはカスタムモジュールエディターによる3D解析のいずれかに使用しました。

原発性腫瘍3Dモデルにおけるin vitro薬剤感受性アッセイとバイオマーカー検出

患者由来オルガノイド（PDO）は、TU-BcX-4IC（原発性トリプルネガティブ乳癌由来の細胞）をタイトスフェアに増殖させたものから、既述のように形成(*4)。ここでは、オルガノイドの形成にマイクロパターンプレートを使って、この方法をさらに最適化。24ウェルAggreWell™ 400マイクロウェルプレートの1ウェルを用いて、約1200個の安定した大きさのPDOを作製することができました。オルガノイドを形成させるために、TU-BcX-4IC細胞をマイクロウェル当たり2,000個の密度でプレーティングし、プレートを2日間培養してコンパクトな3Dオルガノイドを形成させました。100μlのNanoShuttleをウェルに添加し、オルガノイドをNanoShuttleとともに3時間インキュベートした後、PDOを採取してフローチップに移しました。本試験で使用した薬剤はロミデプシンとトラメチニブ。3Dオルガノイドを異なる濃度の薬剤で48時間処理。その後、自動薬物処理と免疫蛍光染色がPu-MAシステム3D MAG内で行われました。生きたサンプルを上記のように生存率染色（カルセインAM、ヘキスト、エチジウムホモダイマー1）で染色した後、サンプルをImageXpress® Micro Confocalシステムでイメージングし、MetaXpress®ソフトウェアのLive-Dead解析モジュールを用いて解析（図5Aおよび5B）。画像は共焦点Z-stack画像として取得され、stack画像は細胞生存率を解析するための2Dプロジェクション画像に圧縮。マルチパラメトリックリードアウトが生成され、濃度反応曲線が解析されました（図4A、4B）。

生細胞と死細胞のパーセンテージは分析により決定され、化合物の有効濃度の算出に用いられました。次にサンプルを固定し、特異性マーカーであるE-カドヘリンとCD44を再染色。

ロミデプシン処理後、PDOの特異性マーカーに対する免疫蛍光染色をPu-MAシステム内で行いました。図5Cに示すように、E-カドヘリンとCD44マーカーが処理後のPDOで検出。共焦点画像はImageXpress® Micro Confocalイメージングシステムを用いて取得。その結果、E-カドヘリンの発現低下と同様に、薬剤処理によるPDOの崩壊が示されました。

結論

我々は、Pu-MAシステム3D MAG上の磁性コート3D細胞マイクロティッシュを用いたアッセイワークフローの改善と、ImageXpress Micro Confocal イメージングシステムを用いたハイコンテントイメージングおよび解析を実証。自動ワークフローとPu-MAシステム3D MAGを組み合わせることで、オルガノイド／スフェロイドの自動処理、分泌因子のin situ培地サンプリング、薬物処理とマルチパラメトリー解析、バイオマーカーの免疫蛍光染色を行う能力が向上しました。

合理化されたワークフローとPu-MAシステムのプロトコルを用いて、異なる薬剤と濃度に反応する異なる3D細胞モデルを用いた染色とイメージングを示しました。私達は、3D腫瘍サンプルにおける薬剤感受性の迅速な評価に使用できます、サンプルの自動薬剤処理、染色、処理、ならびに生存率、マーカー発現、およびイメージングによる表現型の変化の解析を実証しました。

参考文献

1. ヒトオルガノイド： 生物学の理解と疾患治療のためのツール。Schutgens, F. and H. Clevers, (2020) 15(1): p. 211-234, Ann. Rev. of Pathology： Mech. of Disease.
2. オルガノイドの簡単な歴史。Corro C. et al. (2020) 319: C151-C165, Am. J. Physiol.
3. 磁気浮上による三次元組織培養。Souza, G.R. et a.l (2010) 5(4)： 291, Nat. Nanotechnol.
4. 新しいトリプルネガティブ乳癌患者由来異種移植モデルにおける薬剤耐性プロファイリング。Matossian, M.D. et al (2019) 19(1)： 205, BMC Cancer.
5. 3Dがんスフェロイド培養の生存率と形態を特性化するためのハイコンテントアッセイ。Sirenko, O. et al. (2015) 13, 402, Assay and Drug Dev Tech.

謝辞

Matthew Burow博士およびMargarite Matossian博士（Tulane University）。NanoShuttleはGreiner Bio-Oneの好意によりご提供。