Application Note 自動ワークステーションを用いた
セルペインティングアッセイのスループット向上

要旨

Michael Hayes, PhD | Beckman Coulter Life Sciences
Angeline Lim, PhD | モレキュラーデバイス

セルペインティングは、創薬コミュニティにおいて人気のあるスクリーニング手法となっています。この表現型スクリーニングプラットフォームは、ハイコンテント顕微鏡、ハイスループットスクリーニング、リキッドハンドリング、そして膨大な量のデータを生成する計算の進歩を活用しています。セルペインティングアッセイは、目的の表現型を誘導することができる新薬や創薬標的を同定するために、遺伝的摂動や薬剤様低分子ライブラリーと組み合わせて用いられることが多いです。セルペインティングのワークフローは時間と労力を要し、数日を要し、多くのアッセイプレートのスクリーニングを必要とします。Biomek i7 Hybrid自動化ワークステーションのような自動リキッドハンドラーを使用すれば、これらのプロセスを合理化し、貴重な時間を節約し、アッセイのスループットを向上させることができます。ここでは、セルペインティングアッセイプレートを調製する自動ワークフローを開発しました。細胞を染色した後、モレキュラーデバイス ImageXpress® Confocal HT.ai ハイコンテントイメージングシステムを使用して、下流のデータ解析のための高画質画像を取得しました。Biomek i7ハイブリッド自動ワークステーションを用いて、細胞をパラホルムアルデヒド固定し、Triton X-100で透過処理した後、6種類の分光学的に適合性のある蛍光染色の組み合わせで処理しました。また、低分子スクリーニングのセットアップをシミュレートするためのケーススタディとして、コルヒチンの時間経過実験を行いました。ここで発表されたデータは、BiomekリキッドハンドリングとImageXpressイメージングを組み合わせた自動ワークフローが、どのように形態学的プロファイリングに使用できるかを明らかにするものです。

はじめに

最近の細胞生物学の進歩は、ますます複雑なヒト疾患モデルの開発を可能にしています。これらの進歩には、患者由来の人工多能性幹細胞のような新しい細胞モデル、3Dオルガノイドのような新しい培養法、CRISPR/Cas9のような新しい精密な遺伝子編集法などが含まれます。これらの最近の細胞モデルを含む多くのワークフローは、最終的な読み出しとして蛍光イメージングを使用しており、より複雑で情報量の多い実験セットアップの開発につながっています。セルペインティングは、市販されている一般的な蛍光色素をマルチプレックスで使用する細胞形態プロファイリング法です*1。この表現型スクリーニング・プラットフォームは、ハイコンテント顕微鏡、ハイスループット・スクリーニング、リキッドハンドリングの進歩を活用し、大量のデータを生成します。セルペインティングは、遺伝学的スクリーニングや低分子スクリーニングなど、様々な細胞操作の分析に用いられてきました。遺伝子スクリーニングでは、各ウェルに目的の遺伝子を操作するための試薬が封じ込められ、しばしばsiRNAやCRISPR/Cas9が用いられます。低分子スクリーニングでは、数千から数百万の化合物をテストし、薬剤のようなリード化合物を同定します。

セルペインティングスクリーンの実行後、画像ベースのプロファイリングにより、作用機序に基づいた遺伝子／化合物のクラスタリングが可能です*2。さらに、これらのハイコンテントイメージに基づき、人工知能や機械学習を用いて生理学的に関連性のあるモデルシステムで生物学的に活性な化合物を同定することへの関心が高まっています*3。従来のスクリーニングキャンペーンでは、単一の読み出し／測定値を用いて、関心のある表現型に対する各遺伝子／化合物の効果を同定していました。ポストホック分析を使って、観察されたセルペインティングプロファイルに基づいて、既知の対照遺伝子／薬剤条件と実験的治療とをクラスタリングすることができます*4（これは、より多くの画像ベースのデータセットで計算手法が洗練されるにつれて、創薬コミュニティで有用性が増す研究分野です）。

典型的なセルペインティングアッセイの一般的なワークフローを以下に概説します（図1）。まず、細胞を光底マイクロタイタープレートにプレーティングします。一般に、ワークフローのイメージング部分がより簡単になるため、接着細胞が好ましい。次に、細胞をトランスフェクション（遺伝学的スクリーニング）または化合物添加（低分子スクリーニング）のいずれかの方法で、目的の実験条件で処理し、目的の表現型が観察できるまでインキュベートします。その後、細胞を固定し（パラホルムアルデヒド）、透過処理し（Triton X-100）、染色すします（ライブ染色を使用する場合は、固定前に行います）。プレートは、モレキュラーデバイス ImageXpress Confocal HT.ai ハイコンテントイメージングシステムのような自動蛍光コンフォーカル顕微鏡を用いて画像化されます。画像は、IN Carta® 画像解析ソフトウェアやオープンソースの CellProfilerソフトウェアパッケージなどの画像解析ソフトウェアで解析され、測定値は、ウェブベースの StratoMineR（Core Life Analytics）など、細胞形態プロファイルを解析できるデータマイニングパイプラインに供給されます*5。

このワークフローには数日を要し、ユーザーによるいくつかのタッチポイントが必要です。少数の条件しかテストしない場合や96ウェルプレートで作業する場合は、手動ピペッティングでこれらのステップをすべてプレーティングすることも可能ですが、高密度（384ウェル以上）やハイスループットが要求される場合は、手作業でこれらのステップを実行することは現実的ではなくなります。Biomek i7 ハイブリッド自動化ワークステーションは、セルペインティングワークフローの複雑なリキッドハンドリングステップを効率的に実行できる自動リキッドハンドラーです（図2）。これにより、必要なユーザー操作の回数を最小限に抑え、ウォークアウェイ時間を増加させ、オペレーターは他のラボ作業に専念することができます。マルチチャンネルポッドには、それぞれ1～1200 μLおよび0.5～60 μLを正確にピペッティングできる96ウェルまたは384ウェルヘッドを装備できます。さらに、8チャンネルのSpan-8ポッドは、0.5～>1000μLの精度があります。このワークステーションは45のデッキポジションをサポートし、プレートおよびサンプル処理用の環状シェーカー、加熱/冷却ペルチェ、チップウォッシャーなどの装置を直接取り付けることができます（図2）。

さらに、ユーザーのニーズに応じて、Biomek i7 Hybrid ワークステーションは、組織培養インキュベーター、バーコードリーダー、プレートウォッシャー、バルク試薬ディスペンサー、マルチモードプレートリーダー、遠心分離機、自動蛍光顕微鏡など、他の自動プレートハンドリング機器との統合をサポートします。もう一つの重要な特徴は、オプションのHEPAフィルターで、哺乳類細胞培養を扱うときに重要な要素である無菌環境を作り出します。このように、自動セルインキュベーター（例：Liconic、Cytomat、Thermo Fisher）とハイコンテントイメージングを統合したBiomekシステムは、細胞プレーティングから画像取得までのセルペインティングワークフロー全体を、ユーザーによるデッキセットアップのみで行うことができます。ImageXpress Confocal HT.aiハイコンテントイメージングシステムは、7レーザー光源を搭載したスケーラブルなハイスループット、ハイコンテントスクリーニングソリューションです。高輝度レーザーの使用により、画質を損なうことなく露光時間を短縮することができます。これは、LED光源を搭載したシステムと比較して、撮影スピードの大幅な向上につながります。さらに、ImageXpress® Confocal HT.aiは最大8チャンネルのイメージングが可能であるため、セルペインティングのような高度なマルチプレックスアッセイに最適です。

ここでは、Biomek i7 ハイブリッドワークステーションを用いた HEK293 細胞のプレーティングから固定、染色、そして ImageXpress Confocal HT.ai ハイコンテントイメージングシステムを用いた画像取得までの自動ワークフローをご紹介します。自動ワークフローは、スループットを向上させると同時に、作業時間を短縮し、ユーザーによるサンプル操作ミスの可能性を減らすことができます。

方法

細胞培養

Lenti-X 293T細胞（Takara）は、DMEMに10% FBSと1% 100X antibiotic/antimycotic（Gibco）を添加した増殖培地中で、5% CO₂、37℃に維持しました。細胞採取のため、培養液をDPBSで洗浄し、トリプシンで解離させ、Allegra X-14R 遠心機（Beckman Coulter Life Sciences）を用いて300 x gでペレット化し、Opti-MEM Iと増殖培地を1:1で再懸濁しました。細胞を血球計数器で数え、さらにOpti-MEM Iで希釈し、所望の細胞密度100cells/μLにしました。96ウェルプレートでは、HEPAフィルターユニットを装備したBiomek i7ハイブリッドワークステーションを用いて、1ウェル当たり10,000個の細胞をプレーティングしました（総容量100μL）。低分子薬物投与をシミュレートするため、コルヒチンをOpti-MEM Iで1μMに希釈し、Biomek i7ハイブリッドワークステーションを用いて、96ウェル細胞ペインティングアッセイプレートの各ウェルに50μLを指示された時点で添加しました。コルヒチンを含まないOpti-MEM Iをコントロールとしました。

自動セルプレート調製

自動リキッドハンドリング法では、吸引と洗浄の全ステップは1200μLヘッドを備えた96ウェルマルチチャンネルポッドを用いて行い、試薬添加の全ステップはSpan-8ポッドを用いて行いました。自動化メソッドのデッキレイアウトを図3に示します。すべての自動リキッドハンドリングステップは、プレートウェルの中心から70%以上離れた位置から5μL/secで吸引・分注するピペッティングテンプレートを用いて行いました。これにより、ウェル底の細胞単層が、セルペインティング手順の間、邪魔されないことが保証されました。パラホルムアルデヒド溶液は、16％ストック溶液を超純水で6.8％PFAに希釈し、アッセイ当日に新たに調製しました。

まず、ウェルの内容物110μLを吸引し、96ウェルプレートに最終容量40μLを残し、ウェルを110μLのDPBSで2回洗浄しました。次に、60μLのMitoTracker Deep Redを各ウェルに添加し、プレートを暗所、周囲温度で20～30分間インキュベートし、細胞を110μLのDPBSで再度洗浄しました。次に、60μLの6.8％PFAを加えて細胞を固定し、最終濃度を4％PFAにした。プレートを暗所、周囲温度で20分間インキュベートした後、PFAを除去し、細胞を110μLのDPBSで2回洗浄し、各ウェルに最終容量の150μLのDPBSを残しました。プレートを密封し、セルペインティングアッセイを行う日まで4℃で暗所保存し、細胞を染色してイメージングしました。

セルペインティングアッセイ

トリトンX-100浸透液は、トリトンX-100を0.1 mg/mL BSA添加DBPSで0.1%に希釈して作製しました。Hoechst、コンカナバリンA、SYTO 14、WGA、ファロイジン蛍光色素のストック溶液を調製し、Brayら(1)に記載されているように、単一の染色マスターミックスに合わせました。110μLのDPBSで細胞を洗浄した後、120μLのTriton溶液を加え、暗所、周囲温度で10-20分間透過処理しました。その後Tritonを除去し、細胞を110μLのDPBSで2回洗浄した。細胞を、40μLの染色試薬を加え、暗所、周囲温度で30分間染色しました。最後に染色液を除去し、細胞を110μLのDPBSで3回洗浄し、ImageXpress Micro HT.ai ハイコンテントイメージングシステムを用いてプレートをイメージングしました。

画像取得とデータ解析

IN Carta画像解析ソフトウェアを用いて画像を解析しました。画像セグメンテーションプロトコルは以下のように設定しました： 核は、カスタムセグメンテーションで事前に訓練されたモデルNuclei.a.h5を用いて主要ターゲットとして割り当てられました。エッジに触れる対物レンズは除外しました。セルはYFPチャンネル（SYTO14）をロバストオプションでセグメンテーションしました。さらに3つのオルガネラクラスを指定されたオプションでセグメンテーションしました： ミトコンドリア（ネットワーク）、アクチン（線維）、小胞体（ネットワーク）。各細胞コンパートメントから測定値を抽出しました。形状、サイズ、強度、テクスチャー、共焦点化、隣接する対物レンズとの空間的関係などの測定値が解析出力として選択されました。細胞あたり合計487の特徴が抽出されました。

データ解析のために、細胞レベルのデータはCSV形式でエクスポートされ、化合物情報を含むメタデータを含むテキストファイルとともにHC StratoMineR（CoreLife Analytics）にアップロードされました。プレーティングマップはStratoMineRのインターフェイス内で定義されました。Quality Controlタブを使用して、異常値ウェルを解析から除外することができます（50セル未満のウェルは除外された）。データ形質転換は、推奨される方法で行い、その後、フィーチャースケーリングを行った。主成分分析（PCA）はデータ削減のために使用されました。その結果得られた7つの成分を用いて距離スコアを算出し、これはウェル内のセルに対する処理の表現型効果の尺度として定義されます*6。

結果と考察

セルペインティングは、様々な細胞操作の後、豊富な情報を得ることができるため、スクリーニング界で人気を集めています。セルペインティングアッセイのためのプレート調製ワークフローには、特にスクリーニングするプレートの数が増えるにつれて、手作業で行うには非現実的となりうる手間のかかるリキッドハンドリングステップが含まれます(1)。そのため、Biomek i7ハイブリッド・ワークステーションを用いて、以前に記載されたベストプラクティス（実施基準）を用いて、ウォークアウェイ・プレート処理法を開発しました（1）。プレートをプレーティングする前に、細胞はそれぞれ4% PFAと0.1% Triton X-100を用いて固定と透過処理を行いました。ここでは、新たに開発した自動化手法のリキッドハンドリングを、手作業でペインティングした細胞と比較します。

自動ワークフローで評価された最初のパラメーターは、手動ワークフローに対する時間短縮でした。96ウェルプレート1枚を、12ウェルマルチチャンネルピペットとBiomek i7 Hybridワークステーションを用いて手動でプレーティングしました。プレート1枚の場合、どちらのワークフローも完了までに約2時間かかり（手動120分 vs Biomek115分）、合計時間のうち60分は暗所での周囲温度でのインキュベーションでした。Biomek法では、必要な実地時間はデッキのセットアップのためのメソッド開始時の5〜10分のみでした。一方、手動法ではピペッティングに60分を要しました（表1）。さらに、自動メソッドは384ウェルフォーマットに簡単にアダプターできました。384ウェル法では約120分かかったが、ここでも必要な手作業はデッキのセットアップのみでした（5-10分）。384ウェルのワークフローは手作業では行わなかったです。このプレートフォーマットでは、手作業によるピペッティングに3～4時間を要する可能性があり、現実的ではないと考えられたからです。

この新しく開発された自動化法を定性的に評価するために、市販の蛍光染色剤を用いてHEK293細胞を染色しました（図4）。その結果、ほぼ予想通りの染色パターンが得られました。小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、核、RNA（核小体）は、以前に報告されたセルペインティングの結果と一致した染色パターンを示しました（図4）(1)。興味深いことに、ファロイジンによるf-アクチン染色では、ロバスト性の蛍光標識が得られたが、以前のセルペインティングの結果のように、明瞭なアクチンフィラメントは識別できなかったです。これは、HEK細胞株と今回使用したファロイジン染色の濃度との組み合わせによるものかもしれないです。このことは、大規模なスクリーニングを行う前に、目的のセル株に最適な染色濃度を特定するための予備実験が必要かもしれないことを強調しています。さらに重要なことは、この実験の結果から、自動セルペインティングと画像取得のワークフローが機能していることが示されたことです。細胞は各ウェルの底に明瞭に存在し、これは自動リキッドハンドリングが、細胞をプレートに接着させたまま固定するのに十分穏やかであったことを示しています。さらに、いくつかの色素（ファロイジン、コンカナバリン）は通常、細胞に対して不透過性であるため、細胞内コンパートメントの染色は、0.1% Tritonを用いて十分な細胞透過性が達成されたことを示しています。最後に、各チャンネルで観察されたロバスト性の蛍光シグナルは、染色ステップも成功したことを示しています。

セルペインティングはスクリーニング技法として用いられることが多いので、各ウェルには異なる薬物様低分子化合物など、異なる細胞操作が封じ込められることが多いです。このアッセイ設定をシミュレートするために、コルヒチンを対照化合物として選択しました。コルヒチンは、有糸分裂とそれに続く正常な細胞分裂に必要なチューブリンに結合して阻害します。この作用機序から、この薬剤で処理するとHEK293細胞の形態が劇的に変化すると予測されました。Biomekを用いて、細胞をプレーティングし、300 nMのコルヒチンで24時間または4時間処理し、未処理の細胞をコントロールとして用いました。処理後、Biomek i7 ハイブリッドワークステーションとImageXpress Confocal HT.ai ハイコンテントイメージングシステムを用いて、それぞれ細胞をペイントし、イメージングしました。コントロールとコルヒチン処理細胞の間で観察された細胞表現型の違いは劇的でした（図5A、5C）。コルヒチンで処理されたセルは大きく丸くなり、有糸分裂のメタフェースの間に細胞周期が停止したことを示しました。さらに、薬物処理後のウェルあたりの細胞数は少なく、これはおそらく細胞が適切に分裂できなかったためでしょう。

セルペインティングのワークフローのもう一つの重要な部分は、下流の画像とデータ解析である。画像はまず、IN Carta画像解析ソフトウェアを用いて解析された。IN Cartaはディープラーニングに基づくセグメンテーションツール（SINAP）を備えており、ロバスト性のある特徴同定が可能である。解析のために、SINAPの核モデルは核の検出を改善し、触れる核を正確に分割することができた。SYTO14染色を用いて細胞質を定義し、ER、ミトコンドリア、アクチン構造も同定・解析した。全体として、各セルから、強度、テクスチャー、形状、オルガネラ間の空間的関係、および共局在化数を表す487の測定値が得られた。

図5に示した各条件について、24個の複製ウェルから得られた細胞レベルのデータを、HC StratoMineR（Core Life Analytics）のクラウドベースツールに供給しました。主成分分析を用いて、487の測定値を7つの主成分に分類しました。3つの異なるクラスタリングが観察され、各クラスタは単一のコルヒチン処理条件を代表していました（図6）。これは、各レプリケートが同一処理ウェルで正確にクラスタリングされたことから、セルペインティングワークフローにおける自動リキッドハンドリングと画像取得の有用性を強調するものです。また、コルヒチンは、IN CartaとHC StratoMineRを用いた解析で区別できるような、ロバスト性の時間依存的な表現型の違いを誘導したことから、品質管理化合物の有用性も浮き彫りになりました。

上記の結果は、1枚のプレートをプレーティングした場合のものですが、多くのワークフローでは、より大きなライブラリーをスクリーニングするために、複数のプレートを処理する必要があります。これも自動リキッドハンドラーの得意とするところです。Biomekワークステーションは、自動インキュベーター（セル）やハイスループット蛍光顕微鏡（モレキュラーデバイス）のように、自動細胞ハンドリングとイメージングを行うための様々なインテグレーションを取り付けることができます。しかし、プレート洗浄機（BioTek 405）やバルク試薬ディスペンサー（MultiFlo/ Multidrop）を使って細胞洗浄ステップを行いたいユーザーもいるでしょう。幸いなことに、Biomek iSeries はこれらのインストゥルメンテーションと統合することも可能であり、ここで説明したものよりも高度でハイスループットのワークフローを可能にします。さらに、細胞プレーティングプレートの蛍光イメージングは時間がかかる（1プレートあたり1～2時間）ため、一度に複数のプレートをアセンブルしたくないユーザーもいるかもしれないです。ベックマン・コールター・ライフサイエンス社は、SAMI EX スケジューリングソフトウェアも提供しています。このソフトウェアツールを使用すると、固定／浸透／染色中にすべてのプレートがほぼ同じ時間経過で処理されるように、染色やプレート読み取りなどのメソッドコンポーネントをインターリーブするために、高度なタイミングとプレートハンドリング操作をスケジュールすることができます。これらのハードウエアとソフトウエアを組み合わせることで、ハイスループット、ウォークアウェイセルペインティングワークフローを提供することができます。

要約

創薬コミュニティが高度に複雑な疾患モデル細胞を作製する能力を向上させるにつれて、高度に複雑なアッセイの出力に対する関心も高まっています。注目されている方法の一つがセルペインティング法であり、市販のシンプルな細胞染色を数種類マルチプレックスして複雑な表現型データを作成するものです(1)。この表現型解析法を遺伝学的手法（siRNA/CRISPR）や低分子スクリーニングと組み合わせることで、1回の実験から膨大な量のデータを得ることができます。セルペインティングスクリーンの実行後、画像ベースのプロファイリングを用いて、表現型に基づいて遺伝子や化合物をクラスタリングし、推定される作用機序を予測することができます(2)。残念ながら、セルペインティングのワークフローには、アッセイプレートの準備と自動画像取得という2つのボトルネックが残っています。

アッセイプレートを手作業で準備するのは時間と労力のかかるプロセスで、薬剤処理／トランスフェクションの時間経過にもよるが、数日かかることもあります。さらに、細胞の固定／浸透／染色には、96ウェルプレート1枚あたり最大1時間の作業時間が必要となります。これらの障害に対処するため、私たちは、細胞のプレーティング、処理から蛍光染色、画像取得までのセルペインティングワークフローの自動化を追求しました。ここでは、このワークフローの有用性と、Biomek i7 ハイブリッドワークステーションおよびImageXpress Confocal HT.ai ハイコンテントイメージングシステムの機能を紹介します。最初の実験では、自動化された方法を用いて、プレートの培養、固定、染色、イメージングが容易に行えることが示されました。その後の研究により、低分子（コルヒチン）スクリーニングのワークフローが自動化され、この方法を用いて有意義なセルペインティングデータが得られることが示されました。Biomekの自動化とImageXpressイメージングを併用することで、作業時間を短縮し、アッセイのスループットを向上させることができます。

参考文献

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材料

***表2．
使用インストゥルメンテーション

表4. ランごとの消耗品