Application Note ライブセルアッセイの高度化を支援する
インテリジェントタイムラプスイメージング
- あらかじめ設計されたアプリケーションモジュールや、ユーザー作成のカスタムモジュールを使用して画像解析を実施
- 並列画像処理により、解析時間を最大40倍短縮
- 蛍光標識細胞および非標識細胞の活動を長時間にわたり追跡可能
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はじめに
特定の時間経過に沿ってライブセルの応答をモニタリングできることは、アッセイ開発において細胞生物学者に多くの利点をもたらします。ルーチンの細胞ベーススクリーニングでは、タイムコースの結果により、エンドポイントアッセイの最適な測定タイミングを決定することができます。ハイコンテントタイムラプスイメージングは、複数の反応の動態を同時に解析したり、細胞増殖や細胞死をモニタリングしたりするためにも活用できます。
MetaXpress® 画像取得・解析ソフトウェア（バージョン5.1以降）は、タイムラプスイメージングデータの取得と解析を完全に自動化します。タイムシリーズ全体の画像解析は、あらかじめ構成されたアプリケーションモジュール、またはユーザーが設計したカスタムモジュールを使用して実施され、これらはMetaXpress® PowerCore™ ハイコンテント分散型画像解析ソフトウェアと連携して共有・利用することが可能です。解析結果はヒートマップで可視化され、トレンドや外れ値を即座に識別できます。
以下の実験は、環境制御チャンバーを備えたImageXpress® Micro ハイコンテントイメージングシステムを用いて実施され、ライブセルを長時間にわたり装置内で維持することができました。場合によっては、スケジュールされた液体添加や、透過光による非蛍光細胞のイメージングも行われました。
図A
図B
図C
図1. タイムラプス取得と解析の簡単なセットアップ MetaXpressソフトウェアでは、タイムラプス取得を迅速な動態解析（図A）や、複数日間にわたる長時間取得（図B）として設定可能です。ユーザーは「時間間隔」と「実験時間」を入力することで、ソフトウェアが自動的に「取得回数」を計算します。または「取得回数」を入力することで、時間間隔と実験時間を自動計算することも可能です。図Cでは、タイムラプスデータの解析において、適切な設定を選択し「Run Analysis」をクリックするだけで解析が開始されます。
神経突起伸長の発達を測定
この実験では、阻害剤処理の有無にかかわらず、iPSC由来ニューロン（Cellular Dynamics Intl.）を96ウェルプレートに播種し、透過光で18時間イメージングを行いました。MetaXpressソフトウェアのNeurite Outgrowthアプリケーションモジュールを使用して、タイムラプス画像を解析しました。タイムラプス解析オプションにより生成された「時間 × ウェル」データビュー（図2）は、ヒートマップ形式で各時間点・各ウェルのデータを可視化します。予想通り、未処理のニューロンは一晩のイメージング中に複数の長い突起を形成しましたが、スタウロスポリン処理細胞では神経突起伸長が抑制されました（図3）。
図2. ヒートマップによるタイムラプス応答の迅速な評価 神経突起伸長の変化を、18時間にわたる36時間点の「時間 × ウェル」ヒートマップで可視化。A05およびA06ウェルのニューロンは10 µMスタウロスポリンで処理され、その他のウェルでは未処理または成長因子のみで処理されました。
図3. 非標識細胞における神経突起伸長の経時的追跡 左：染色されていない神経突起の透過光画像と、解析結果の神経突起伸長マスク（赤）。未処理コントロール細胞（上）と10 µMスタウロスポリン処理細胞（下）では、36時間点後の形態に明確な違いが見られました。右：AcuityXpress ハイコンテント情報解析ソフトウェアによる解析結果。各時間点（x軸）における細胞ごとの神経突起の中央値長（y軸）を表示。未処理細胞（上のトレース）は有意な伸長を示し、スタウロスポリン処理細胞（下のトレース）は伸長が抑制されました。
化合物処理による細胞増殖への影響をリアルタイムで追跡
ライブセルのタイムラプス実験は、がんに関連する異常な細胞増殖の制御をより深く理解するための有用な情報を提供し、細胞の制御不能な分裂を抑制する治療法の開発に貢献します。
**GFPを発現するU2OS細胞（Transfluor®アッセイ）**を一晩培養し、10X Plan Fluor対物レンズを用いて30分ごとにイメージングを行いました。画像は、MetaXpressソフトウェア用にユーザーが開発したカスタムモジュールで解析され、細胞質内のGFPを用いて細胞を識別し、核が占める非染色領域を補完することで、堅牢なセルカウントを実現しました。2つのクローンのタイムラプス解析では、初期の細胞数および増殖速度に違いが見られました（図4）。
図4. 広視野イメージングにより、多数の細胞の増殖率を定量 上：GFPを発現するU2OS細胞を一晩培養し、取得した「時間 × ウェル」ヒートマップデータ。A04〜A06ウェルのクローンは、A07〜A08ウェルのクローンよりも細胞数が多くなっています。下：カスタムモジュールにより、フラットフィールド（シェーディング）補正を行わずにイメージングした場合でも、正確に細胞を識別できました。
数日間にわたる細胞死のメカニズムを解析
HeLa細胞に対し、アポトーシスマーカーとしてNucView-488（緑）、ネクローシスマーカーとしてPropidium Iodide（赤）、さらにHoechst核染色を用いて染色を行いました。細胞には過酸化物、エトポシド、または未処理の条件で処理を行い、43時間にわたり30分間隔でイメージングを実施しました（図5・上）。画像は、タイムラプス画像解析オプションを用いたカスタムモジュールで解析されました。実験終了時のセルヘルスやアポトーシスの状態は、ウェル配置ヒートマップで視覚的に表示されました（図5・下）。
タイムラプスで測定されたパラメーター（全体の生存率、初期アポトーシス、後期アポトーシス、ネクローシスなど）のプロファイルは、 AcuityXpress™ ソフトウェアを用いて解析され、図6に示されています。
図5. 細胞死の結果を視覚的にスナップショット表示 上：ライブセル実験中のHeLa細胞画像。処理条件により多様な結果が得られました。未処理コントロール細胞（左）は、1時間後（時間点2）にほとんどが生存核（ロイヤルブルーのマスク）を示しました。25時間後（時間点50）には、エトポシド処理細胞（中央）の多くが初期アポトーシス（ピンクのマスク）または後期アポトーシス（白のマスク）を示しました。過酸化物処理細胞（右）は、43時間後（時間点86）に主に後期アポトーシス（白のマスク）を示し、一部はネクローシス（紫のマスク）を示しました。下：ヒートマップにより、エトポシド処理（D列・E列）、過酸化物処理（F列・G列）、未処理（B列・C列）の細胞反応を実験終了時に即座に可視化できます。
図6. 3種類の処理条件におけるタイムラプスデータのプロット コントロール、過酸化物処理（H₂O₂）、エトポシド処理（Et）を行ったHeLa細胞の43時間にわたるタイムラプスプロット。処理条件により、細胞死のメカニズムに違いが見られました。
ヒト心筋細胞の拍動率をカウント
培養された心筋細胞は、同期して拍動するシンシチウムを形成し、ネイティブな心筋細胞と類似した挙動を示します。カルシウムレベルの振動は、細胞の同期的な収縮とともに発生し、カルシウム感受性染色を用いてモニタリングすることができます。処理による振動パターンの変化も観察可能です。
**iPSC由来心筋細胞（Cellular Dynamics Intl.）**は、FLIPR® Calcium 6 Assay Kitの染色を用いてカルシウムの変動をモニタリングし、タイムラプスモードで1秒間に3回のイメージングを行い、合計100時間点の画像を取得しました。カルシウムフラックスを測定するため、シンプルな閾値を用いた2ステップのカスタムモジュールが作成され、データ解析に使用されました。「時間 × ウェル」ヒートマップおよび画像サムネイルに表示された明暗の蛍光パターンにより、拍動率が示されました。
結論
制御された細胞環境を必要とする複雑なタイムラプス実験の自動評価は、環境制御チャンバーを備えたImageXpress Microシステムで容易に実施可能です。各時間点で取得された画像は、MetaXpressおよびAcuityXpressソフトウェアを用いて即座にデータ可視化・解析が可能です。さらに、数千枚の多波長画像から有意な数値を迅速に抽出する必要がある場合でも、MetaXpress PowerCoreソフトウェアを使用することで、解析時間を最大40倍短縮できます。カスタム設計された解析モジュールを使用する場合でも同様です。これらのツールにより、多様なライブセルの生物学的プロセスを効率的かつ高精度に解析することが可能になります。
図7. 心筋細胞の拍動パターンを時間経過で可視化 タイムラプスイメージングを用いた心筋細胞の拍動パターンの可視化。画像解析後、MetaXpress Image Analysis Softwareでタイムコース反応のプロットを表示可能です。単一ウェルのプロット（青）は、「Show Graph」（赤丸）をクリックすることで表示されます。
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