Application Note SpectraMax i3 マルチモードマイクロプレートプラットフォームによる
トリプトファンの本質的検出

  • タンパク質分析のための高感度フルオロトリプトファン検出
  • スペクトルスキャンによるピークシフトの自動同定
  • スペクトル最適化ウィザードによる迅速なアッセイ最適化
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はじめに

タンパク質の固有蛍光は、芳香族アミノ酸であるトリプトファン、チロシン、フェニルアラニンによるものです。トリプトファンは270-280 nm付近で最大に励起され、水中では350 nm付近に発光ピークを持ちます。トリプトファンはタンパク質の発光を支配し、溶媒の偏光や局所環境に最も敏感です。タンパク質が変性したときに起こるトリプトファン残基の水への露出は、より長いEmission波長へのシフトをもたらします。このピーク発光のシフトを利用して、タンパク質のアンフォールディングをモニターすることができます。

このアプリケーションプロトコルでは、内在性トリプトファン蛍光を測定するアッセイ用のSpectraMax® i3 マルチモードマイクロプレートプラットフォームの性能を実証します。トリプトファン標準曲線を用いて高感度を示し、リゾチーム変性アッセイを用いてピーク発光のシフトを示します。リゾチームには2つのトリプトファン残基が封入されており、UV光で励起されると蛍光を発します。リゾチームが変性すると、トリプトファンのEmissionピークは通常約6-10 nmシフトします。このピークシフトは、ネイティブおよび変性リゾチームの蛍光スペクトルスキャンを行うことで測定できます。

SpectraMax i3 プラットフォームは、トリプトファン本来の蛍光測定に必要な感度と Wavelength スキャン機能を備えています。さらに、SoftMax® Proソフトウェアは、自動的にEmissionピークを同定し、ピークシフトを計算することができるため、解析が効率化されます。

材料と方法

  • SpectraMax i3 マルチモードマイクロプレートリーダー
  • L-トリプトファン (Sigma P/N T-0254)
  • リゾチーム（Sigma P/N L6876）
  • 塩酸グアニジン（Sigma P/N G7294）
  • 黒壁、UVクリア96ウェルマイクロプレート（Greiner P/N 655809）
  • リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7.4

標準曲線

1mMのトリプトファンの標準溶液をPBSで調製し、7.8nMまで1:2で連続希釈しました。標準溶液は、黒壁透明底96ウェルプレートに1ウェルあたり200μLずつ4回に分けてプレーティングしました。検出下限を算出するためのブランクとして、PBSのみを封じ込めたウェルを8つ用意しました。

SpectraMax i3 Readerで励起と発光のスキャンを行い、最適な感度を与える波長ペアを決定しました。検出下限（LLD）は、ブランクウェルの標準偏差の3倍に基づいて算出しました。

タンパク質変性アッセイ

最終濃度5 Mの塩酸グアニジンを用いて、10 mg/mLのリゾチーム溶液を変性させました。SpectraMax i3 Multi-Mode Platformを用い、励起波長270 nm、エミッション波長300～450 nmの範囲で、ネイティブおよび変性リゾチームサンプルのスペクトルスキャンを行いました。発光ピークは、SoftMax Proソフトウェアにあらかじめ設定されたプロトコルを用いて自動的に同定しました。

結果

調整可能なSpectraMax i3 Multi-Mode Platformで270 nmの励起と350 nmの Emissionを用いると、トリプトファンを約6 nMまで検出することができました（図1）。このレベルの感度は、変性研究や、エミッションピークのシフトが起こるその他の研究において、タンパク質を測定するには十分すぎるほどです。ネイティブおよび変性リゾチームサンプルのスペクトルスキャンでは、変性に伴い、蛍光強度の増加とともに、発光ピークが351 nmから361 nmにシフトすることが示されました（図2）。

SpectraMax iD3 リーダーは、最適な Wavelength の組み合わせにより、トリプトファン標準曲線を 9.5 nM の検出下限と r2 > 0.99 の優れた直線性で正確に測定することができました（図 2）。

図1. トリプトファン標準曲線。トリプトファンをPBSで連続希釈して標準曲線を作成しました。6 nMまでの直線性と感度が示されました。

図2. 変性リゾチームのピークシフト。上：ネイティブ（赤）と変性（青）リゾチームの発光スペクトルスキャン。10nmのピークシフトが観察されました。下： SoftMax Proソフトウェアのグループテーブル。事前に設定されたプロトコルにおけるピークシフトの自動解析を示します。

結論

SpectraMax i3 マルチモードプレートリーダーは、内在性トリプトファン蛍光の測定によるタンパク質の特性解析を可能にします。帯域幅を調整できるモノクロメーター光学系は、6 nMのトリプトファンまで優れた感度を提供し、タンパク質の変性時に発生する蛍光発光ピークのシフトを正確に決定します。SoftMax Proソフトウェアのプロトコルにより、ピーク波長とピーク波長シフトが自動的に特定されるため、分析時間を短縮できます。

Molecular DevicesのSpectraMax® i3プラットフォームは、幅広いアプリケーションの可能性を提供するマルチモード検出システムです。モノクロメーター光学系は吸光度、蛍光、ルミネセンスをサポートし、ユーザー交換可能なカートリッジは時間分解蛍光、蛍光偏光、AlphaScreenモードへとシステムの検出を拡張します。ユーザーによるアップグレードが可能なSpectraMax® MiniMax™ Imaging Cytometerオプションにより、このプラットフォームは最も汎用性の高いマイクロプレート検出システムのひとつとなります。

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