Application Note FLIPR Tetraによるライブセル Gᵢ / Gₛ GPCRシグナル測定

  • GloSensor cAMP細胞株およびGloSensor cAMPプラスミドを用いた柔軟なアッセイ開発
  • 主要なGPCRサブタイプの動態スクリーニングに対応する包括的ソリューション
  • 複数のマイクロプレートフォーマットに対応したスケーラブルなアッセイスループットと、自動化との容易な統合
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はじめに

このアプリケーションプロトコールでは、FLIPR Tetra®システム上で、改良型の発光性ホタルルシフェラーゼベースの Promega GloSensor™ cAMPアッセイを使用し、cAMPを介した Gₛ- および Gᵢ- 共役GPCR活性をキネティックモードで検出する方法を示します。このアッセイにより、これらのGPCRサブタイプを、細胞内cAMP濃度の変化という関連するセカンドメッセンジャー機構を測定するライブセルアッセイで評価できるようになりました。

Gₛ- および Gᵢ- 共役GPCRのセカンドメッセンジャーシグナル活性の検出は、従来、細胞溶解を必要とする放射性結合アッセイやエンドポイントcAMPアッセイなどで行われてきました。これらのアッセイは細胞応答の単一タイムポイントで活性を測定するため、キネティック情報は得られません。別の方法として、Gₛ- および Gᵢ- GPCRをGα16に強制的に共役させ、アゴニストによる受容体活性化後のカルシウムフラックスを蛍光で検出する手法があります。しかし、このアッセイも生理的に関連するcAMP経路を介してシグナルを伝達しないため、最適とは言えません。

本プロトコールでは、GloSensorプラスミドを安定発現するCHO-K1およびHEK293細胞株における内因性受容体活性を示します。さらに、Gₛ- および Gᵢ- 共役受容体を安定的にトランスフェクトした細胞株や、GloSensorプラスミドを一過性にトランスフェクトした細胞株での活性も測定します。GloSensor cAMPアッセイと組み合わせることで、FLIPR Tetraシステムは主要なGPCRサブタイプのキネティックスクリーニングに対応する柔軟で包括的なソリューションを提供します。

図1に示すように、GloSensor cAMPアッセイは、cAMP結合ドメインをネイティブホタルルシフェラーゼのN末端およびC末端に融合して作成されました。cAMPが存在しない場合、cAMP結合ドメインを含む遺伝子改変ルシフェラーゼは不活性状態にあります。cAMP結合時には、cAMP結合ドメインの構造変化により活性状態で発光が増加し、FLIPR Tetraシステム上で生細胞において検出可能になります。両方のルシフェラーゼ形態は、ルシフェラーゼ基質の存在下で表現されます。GloSensor cAMPアッセイの詳細については、テクニカルマニュアル（Cat# TM076, Promega）をご参照ください。Gₛ- および Gᵢ- 共役GPCRアッセイの柔軟な設計は、一過性または安定トランスフェクション用のプラスミドを組み合わせることで可能です。Promegaから入手可能な細胞株または研究室で利用可能なターゲット細胞株を用いた4つのオプションを以下に示します。

図1. GloSensor cAMPアッセイの細胞内バイオセンサー（Promega社提供）

柔軟なGloSensor cAMPアッセイ設計

  • 安定受容体と安定 GloSensor cAMP アッセイ
  • 一過性受容体と安定GloSensor cAMPアッセイ
  • 安定受容体と一過性GloSensor cAMPアッセイ
  • 一過性受容体と一過性GloSensor cAMPアッセイ

FLIPR Tetraシステムについて：

  • 柔軟なICCDカメラにより、ルシフェラーゼアッセイの発光検出と蛍光検出が可能
  • FLIPR TetraシステムのICCDカメラにより、ライブセルでのcAMP発光シグナルのキネティック測定を実現
  • スケーラブルなアッセイスループット：96、384、1536ウェルプレートフォーマットに対応し、自動化との容易な統合が可能

材料

cAMP細胞株とプラスミド

  • GloSensor cAMP HEK 293 安定細胞株（Promega）
  • GloSensor cAMP 23F CHO K1 安定細胞株（Promega）
  • ラット Y2R/GloSensor cAMP 23F CHO-K1 二重安定細胞株（Promega）
  • GloSensor cAMP アッセイプラスミド pGlosensor-22FcAMP （Promega）
  • ドーパミンD4安定HEK 293T細胞株（Multispan Inc.）

図2. 安定GloSensor cAMP-23F HEK 293細胞 安定GloSensor cAMP-22F HEK 293細胞株を用いて、FLIPR TetraシステムでのGloSensor cAMPアッセイを実証しました。ICCDカメラは、改変ホタルルシフェラーゼからの発光シグナルを30分間検出しました。(A) FLIPR ScreenWorksによる平均シグナルトレース。cAMP HEK 293細胞の内因性 Gₛ を介したβ₂アドレノセプター応答をサルブタモール刺激で測定しました。ベースラインシグナルに対して約350倍の増加を示します。(B) HEK 293細胞株の内因性β₂アドレナリン受容体に対するイソプロテレノールによる完全アゴニズムと、サルブタモールによる部分アゴニズムです。

細胞培養試薬

  • HEK 293 細胞増殖培地：90% DMEM（Life Technologies）、10% FBS（Hyclone）、200 µg/mL ハイグロマイシン B（Sigma)
  • GloSensor cAMP-23F CHO-K1 細胞増殖培地：90% F-12 Medium (Life Technologies), 10% FBS, 200 mg/mL hygromycin B)
  • Glo Sensor cAMP-23F/Y2R CHO-K1 二重安定細胞増殖培地：90% F-12 Medium (Life Technologies), 10% FBS, and 200 µg/mL hygromycin B), and 500 µg/mL G418 (Life Technologies)

図3. イソプロテレノールとサルブタモールのアンタゴニズム 3種類の既知阻害剤によるイソプロテレノールおよびサルブタモール応答のアンタゴニズムです。 (A) EC₈₀イソプロテレノール応答の阻害です。(B) EC₈₀サルブタモール応答の阻害です。堅牢なシグナルウィンドウにより、Z因子は0.7以上を達成しました。

アッセイ試薬

  • プレーティング培地：90% CO₂非依存培地（Life Technologies）、10% FBS
  • HEPESバッファー： HEPESを脱イオン水で10mMに再懸濁し、KOHを用いてpHを7.5に調整
  • GloSensor cAMP 試薬ストック溶液： 250 mg の GloSensor cAMP 試薬（Promega）を 8.17 mL の HEPES 緩衝液に懸濁
  • 平衡化培地： 最適化が必要
  • 化合物：(-)-イソプロテレノール（Sigma）；サルブタモール（Sigma）；プロプラノロール（Sigma）；ピンドロール（Sigma）；アルプレノロール（Sigma）；ドーパミン（Sigma）。
  • ペプチドYY(3-36)、(Tocris); すべての化合物ストック溶液は10 mMで作成し、HBSS + 20 mM HEPESでさらに希釈しました

図4. Gᵢ共役アゴニズムの結果 Gᵢ共役受容体のアゴニズムは、細胞内cAMPの減少に関連するシグナル低下を引き起こします。cAMP活性のベースライン増加はフォルスコリン添加によって誘導しました。CHO-K1細胞に安定発現するP2Y受容体を用い、アゴニストの前後でフォルスコリンを添加した場合の結果を比較しました。(A) 10 µMフォルスコリン添加後、15分後にアゴニストPeptide YY(3-36)をFLIPR Tetraシステムで添加しました。(B) Peptide YY(3-36)をフォルスコリン添加の15分前に添加しました。両方法とも、cAMP産生の阻害に関連するシグナル低下を示し、アッセイの柔軟性を実証しました。

図5. Gᵢ共役D4受容体を過剰発現するHEK 293細胞 Multispan社由来のGᵢ共役ドーパミンD4受容体を過剰発現するHEK 293細胞に、GloSensor cAMP-22Fプラスミドを一過性にトランスフェクトしました。リガンドをウェルにオンラインで添加し、5分間インキュベート。その後、FLIPR Tetraシステムで10 µMフォルスコリンを添加し、細胞内cAMP産生を刺激しました。(A) ドーパミンによるフォルスコリン媒介cAMP産生の阻害。(B) ドーパミンD4受容体特異的化合物PD168,077によるフォルスコリン媒介cAMP産生の阻害。

方法

安定GloSensor cAMP細胞株アッセイ手順

ステップ1: 細胞を384ウェル黒壁透明底プレート（Corning, Cat.#3712）に一晩培養しました。

ステップ2: アッセイの2時間前に培養液を除去し、GloSensor cAMP試薬を含む平衡化メディア30 µL/ウェルで、37°C・5% CO₂で1時間、その後室温で1時間インキュベートしました。

  • HEK細胞株：2% GloSensor cAMP試薬
  • CHO-K1細胞株：5% GloSensor cAMP試薬

ステップ3: キネティックリード中にFLIPR Tetraシステムで5X化合物を添加しました。

ステップ4: 10～30秒ごとに10～25分間露光しました。

ステップ5: 一般に、Gᵢ共役受容体アッセイはキネティクスが遅いため、全体の測定時間が長くなります。FLIPR Tetraのセットアップパラメータは表1に記載しました。

パラメーター 設定
ICCDカメラモード

発光
ゲイン

280,000
ゲート

100%
リード数

60–180
露光時間

1秒
読み取り時間間隔

10秒
ピペッターヘッド

384ウェル、黒色チップ付き
吸引量

7.5 µL
ディスペンス高さ

20 µL
吐出速度

30 µL/秒

※ 発光シグナルが低い場合、最大9秒の露光を推奨します。条件は最適化が必要です。

表1. FLIPR Tetraシステムのセットアップパラメーター

図6. 一過性トランスフェクション GloSensor cAMP-22Fと内因性Gₛ共役cAMP応答の一過性トランスフェクション（HEK 293細胞）。(A) イソプロテレノールへの応答 (B) 100 nMイソプロテレノール応答のプロプラノロールによる阻害 結果は、図2に示した安定GloSensor HEK-22F細胞株での実験結果と同等でした。

ステップ6: データはFLIPR ScreenWorks®ソフトウェアからGraphPad Prism 5にエクスポートして解析しました。

一過性GloSensor cAMPトランスフェクション手順（安定トランスフェクトGPCR細胞株および内因性受容体細胞株）

ステップ1：抗生物質なしで細胞を37°C、5% CO₂で一晩培養し、70～80%コンフルエントにします。

ステップ2： ppGloSensor cAMPプラスミドをOpti-Mem低血清メディアで20 ng/mLに希釈し、最終的に1 µg DNA/mLになるよう調製します。

ステップ 3：Fugene HDトランスフェクション試薬（Roche, Cat.#0409705001）をDNA 1 µgあたり3:1比率で混合し、室温で15分インキュベート後、マイクロプレートに添加します。

ステップ4: 先にリフトした細胞（0.48 million/mL）にDNA複合体を添加します（HEK-D4の場合、12000 cells/25 µL/well）。

ステップ5：細胞株に応じて、8000～12000 cells/wellで播種し、37°C、5% CO₂で2日間培養します。

ステップ6： アッセイ当日、培養液を除去し、GloSensor cAMP試薬（2～6% f/v）を含む平衡化メディア30 µLを添加します。

ステップ7：37°Cで1時間、室温でさらに1時間インキュベートします。

ステップ8：表1のFLIPR Tetraシステム設定に従い、キネティックリード中に6X化合物を添加します。

結論

FLIPR TetraシステムとGloSensor cAMPアッセイの使用により、標準プレートリーダーのエンドポイントアッセイでは不可能な Gᵢ- および Gₛ- 共役受容体シグナルのキネティック測定が可能になります。

また、GloSensor cAMP細胞株やGloSensor cAMPプラスミドを用いたアッセイ開発の柔軟性を、内因性受容体細胞株および安定トランスフェクト受容体細胞株で実証しました。

謝辞

Pete Stecha, Promega Corporation

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