Application Note SpectraMax ABS Plusで
微量DNA・タンパク質をハイスループット検出
- 190～1000 nmの波長範囲で定量実験の幅を広げます
- SpectraDrop 微量サンプル測定プレートを使用して、感度を維持しながらサンプル量を最小化します
- SoftMax Proソフトウェアの事前設定済みプロトコールで、実験を簡素化し迅速化します
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はじめに
Hoang Ha｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
核酸およびタンパク質の定量は、遺伝学や分子生物学における高度なアッセイの前段階で不可欠な測定です。これらの生体成分を定量するためにさまざまな方法が開発されていますが、最も一般的に使用されている技術は依然として紫外線（UV）分光光度法です。分光光度法の原理は、すべての分子が特定の波長範囲で光を吸収または透過するという性質に基づいており、試料のモル吸光係数と測定パス長に関する事前の知識を用いて、Beer-Lambertの法則（式1）により濃度を算出できます。
\( A = \varepsilon c L \)
式1：Beer-Lambertの法則は、吸光度（A）が測定対象分子のモル吸光係数（ε）、濃度（c）、および測定に使用するパス長（L）の積に等しいことを示しています。この式を変形することで、吸光度から濃度を算出できます。
核酸の定量は非常に確立された技術であり、その基本原理は開発以来ほとんど変更されていません。核酸濃度を算出するために、試料は260 nmで測定され、純度確認のために230 nmおよび280 nmで補助的な測定が行われます。
タンパク質試料もUV分光光度法で定量できますが、より正確な比色アッセイが利用可能です。UV分光光度法では、トリプトファンの芳香族性質を利用して280 nmで光を吸収しますが、アミノ酸配列中のトリプトファン残基の量によって算出されたタンパク質濃度が偏る可能性があります。代替法として、Bicinchoninic Acid（BCA）タンパク質アッセイは、アミノ酸配列や長さに依存せずタンパク質濃度を測定できます。このアッセイは、アルカリ環境下でアミノ酸骨格が銅分子と結合し、カラーチェレート複合体を形成する銅ベースのBiuret反応を利用します。
SpectraMax® ABS Plus マイクロプレートリーダーは、これらの定量アッセイに最適なコンパクトなUV-Vis吸光度マイクロプレートリーダーです。本資料では、SpectraDrop™ 微量サンプル測定プレートおよびSoftMax® Proソフトウェアと組み合わせたABS Plusプレートリーダーによる二本鎖DNAおよびウシ血清アルブミン（BSA）タンパク質の定量方法を紹介します。
材料
- SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
- SpectraDrop™微量サンプル測定プレート（モレキュラーデバイス）
- 96ウェル、透明、平底ポリスチレンマイクロプレート（Greiner Bio-One）
- UltraPure™ Calf Thymus DNA Solution（ThermoFisher Scientific）
- Pierce BCAタンパク質アッセイキット（ThermoFisher Scientific）
- Pierce ™ ウシ血清アルブミン標準アンプル、2 mg/mL（ThermoFisher Scientific）
- UV-Star ® 96ウェルマイクロプレート（Greiner Bio-One）
方法
DNA定量
1000 ng/µLから開始する二本鎖DNAの2倍希釈系列を、UltraPure子牛胸腺DNAを1x PBSで希釈して調製しました。試料の2 µLまたは4 µLを64ウェルSpectraDropプレートに分注し、それぞれ0.5 mmまたは1.0 mmのカバーガラスでDNA試料を覆いました。SoftMax Proソフトウェアで事前設定済みプロトコール「SpectraDrop DNA Quantitation」を開き、提供された設定でプレートを測定しました。データには対数-対数カーブフィットを適用し、標準曲線をSoftMax Proソフトウェアで生成しました。さらに、220 nmから350 nmまで4 nm刻みのスペクトルスキャンをすべての濃度で実施し、試料の純度を評価しました。
DNA定量はキュベットまたはマイクロプレートフォーマットでも比較しました。250 ng/µLから0.5 ng/µLまでの2倍希釈系列を、UV透過96ウェルマイクロプレートに各ウェル200 µL、または複数のUV-Visキュベットに1000 µL分注しました。両フォーマットをSpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダーで260 nmで測定し、各データセットに対数-対数カーブフィットを適用し、標準曲線をSoftMax Proソフトウェアで生成しました。
タンパク質定量
BCAアッセイの標準曲線は、アッセイキットのプロトコールに従って提供されたBSAを希釈して調製しました。タンパク質標準液25 µLとBCA作業試薬200 µLを96ウェルクリアマイクロプレートに分注し、37°Cで30分間インキュベートしました。SoftMax Proソフトウェアで事前設定済みプロトコール「BCA」を開き、提供された設定で562 nmでプレートを測定しました。データには二次曲線フィットを適用し、標準曲線をSoftMax Proソフトウェアで生成しました。
結果
ABS Plus マイクロプレートリーダーは、低容量および標準マイクロプレートの両方の方法で二本鎖DNA濃度を定量できました。SpectraDropプレートと事前設定済みプロトコールを使用することで、ABS Plusマイクロプレートリーダーはわずか4 µLの試料で2 ng/µLまで検出でき、A₂₆₀/A₂₈₀およびA₂₆₀/A₂₃₀比などの関連パラメータを自動的に測定・計算しました（図1および図2）。さらに、スペクトルスキャンにより試料がコンタミネーションフリーであることが確認されました（図3）。
図1. SpectraDrop 微量サンプル測定プレートでのdsDNA定量 ABS PlusプレートリーダーとSpectraDropプレートは、1.0 mm（青）および0.5 mm（赤）のカバーガラスを使用して、それぞれ2 ng/µLおよび4 ng/µLのDNAを検出できました。
図2. SoftMax Proソフトウェアの事前設定済みデータテーブル ソフトウェアの事前設定済みプロトコールにより、未知試料の吸光度比や濃度を自動計算し、DNA定量実験を簡素化します。
図3. SoftMax Proソフトウェアによるスペクトルスキャン 試料純度を評価するためにスペクトルスキャンを実施しました。DNAの4つの代表的な濃度をスキャンした結果、260 nmでのみピークが確認され、純粋なdsDNAであることが示されました。
さらに、ABS PlusマイクロプレートリーダーはマイクロプレートフォーマットでdsDNAを定量できます。UV透過マイクロプレートを使用することで、0.5 ng/µLのdsDNAまで測定可能でした（図4）。
図4. 96ウェルマイクロプレートまたはキュベットでのdsDNA定量 dsDNA希釈系列は、キュベットおよびマイクロプレートフォーマットの両方で250 ng/µLから0.50 ng/µLまで検出可能でした。さらに、両方の希釈系列は高い直線性を示しました。
最後に、SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダーは、BCAアッセイを用いてタンパク質試料を定量できます。提供されたプロトコールに従ってBSA標準液を測定し、アッセイキットの文献に記載された曲線と同等の標準曲線を生成しました（図5）。
図5. BCAアッセイ標準曲線 ABS Plusマイクロプレートリーダーは、BCAアッセイのBSA標準液を検出できました。SoftMax Proソフトウェアを使用してデータポイントに二次曲線フィットを適用し、r² = 1.000の堅牢な標準曲線を生成しました。
結論
SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダーは、キュベットやマイクロプレートなどさまざまなフォーマットで核酸およびタンパク質試料を定量できるコンパクトで柔軟なマイクロプレートリーダーです。SpectraDrop 微量サンプル測定プレートと組み合わせることで、わずか2 µLの試料で最大64サンプルを1回の測定で定量できます。さらに、SoftMax Proソフトウェアの事前設定済みプロトコールにより、実験の最適化と迅速な結果取得が可能になります。
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