Application Note SpectraMax Miniマルチモードマイクロプレートリーダーでの
微量核酸の定量法

はじめに

キャシー・オルセン博士｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

核酸の定量法は、遺伝学、分子生物学、細胞生物学における多くのワークフローの一部であり、不可欠なアッセイである。核酸の定量法には様々な方法が開発されているが、最も一般的に用いられているのはやはり紫外線（UV）分光光度法である。分光光度法の基本は、すべての分子がある波長範囲の光を吸収または透過することであり、試料のモル吸光係数と測定光路長を事前に知っていれば、ランベルト・ベールの法則（下式）を用いて濃度を計算することができる。

A = εcL

ランベルト・ベールの法則では、吸光度（A）は測定した試料のモル吸光係数（ε）に、濃度（c）と測定に用いた光路長（L）を掛けたものに等しいとされています。式を並べ替えると、測定した吸光度値を使って濃度を計算することができます。

核酸の定量法は非常に確立された技術であり、ライフサイエンス研究室で最も広く使用されている方法の一つである。核酸濃度を計算するには、試料の吸光度を260 nmで測定します（試料の純度を評価するために230 nmと280 nmの波長で補助的な測定を行うことがありますが、濃度の決定には必要ありません）。波長260 nmでの吸光度測定値と試料の消衰係数および光路長を上記の式に代入し、試料濃度を算出します。

キュベットでサンプルを1つずつ測定する場合、次のような問題があります。
があります。SpectraDrop™マイクロプレートを使用すると、SpectraMax®マイクロプレートリーダーで1プレートあたり最大64サンプルを、わずか2 μLのサンプル量で読み取ることができます。SpectraDropマイクロプレートには、特別に設計されたアダプターおよび光学的透明度の高いスライドベアが組み込まれており、吸光度モードおよび蛍光モードでの測定が可能で、ユーザーのアプリケーションニーズに対応します（図1）。SpectraDropマイクロプレートのスライドデザインは、キャリブレーションの必要性をなくし、5％以下のCVでウェル間の一貫した読み取り値を実現します。SpectraMax Miniマルチモードマイクロプレートリーダーと組み合わせることで、スループットが向上し、わずか数マイクロリットルのサンプルで2 ng/μLという低濃度のDNAを検出できます。

材料

• SpectraDrop™マイクロボリュームマイクロプレート
• 二本鎖DNA（UltraPure™ Calf Thymus DNA Solution, 10 mg/mL, ThermoFisher Scientific cat. #15633019)
• TEバッファー
• 2μLまたは4μLのピペッティングが可能な8チャンネルピペッター
• SpectraMax®ミニマルチモードマイクロプレートリーダー

方法と結果

0.98ng/μLから1000ng/μLまでの既知濃度のDNAスタンダードをTEバッファーで調製し、8チャンネルピペッターを用いて、TEバッファーブランクとともに、4レプリケートセットで64ウェルSpectraDropプレートのウェルにピペッティングした。1サンプルあたりの量は、0.5mmスペーサー付きSpectraDropトップスライドを使用した場合は2μL、1mmスペーサー付きトップスライドを使用した場合は4μLでした。

SpectraDropプレートをSpectraMax Miniリーダーで読み取り、SoftMax® Proソフトウェアでデータを解析およびプレーティングした。

0.98ng/μLから1000ng/μLまで、3十数年のDNA濃度範囲を表すスタンダードは、SoftMax Proソフトウェアで線形またはlog-logカーブフィットを用いてプロットした場合、r2値が0.99を超える線形であった（図2）。

バックグラウンドの標準偏差の3倍の計算に基づくこの二本鎖DNAの検出下限は、2μLサンプルを使用した場合は3ng/μL未満、4μLサンプルを使用した場合は2ng/μL未満であった。

結論

SpectraMax Miniマルチモードマイクロプレートリーダーは、さまざまなマイクロプレートフォーマットのサンプルを定量できる、コンパクトで汎用性の高いマイクロプレートリーダーです。SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートと組み合わせることで、1回の読み取りでわずか2μLのサンプル量で最大64サンプルを定量できます。