Application Note FLIPR Tetraシステムによる
iCell Cardiomyocytes2のカルシウムオシレーション測定
- 細胞培養時間の短縮によりアッセイのワークフローと品質を向上
- 創薬プロセスの早期段階で安全性に懸念のある化合物を特定
- ScreenWorks Peak Proソフトウェアによりデータ解析を簡素化
PDF版（英語）
Carole Crittenden | アプリケーションサイエンティスト | モレキュラーデバイス
Oksana Sirenko, PhD | リサーチサイエンティスト | モレキュラーデバイス
はじめに
化合物の有効性および安全性を評価するためのスクリーニングコストは増加し続けており、創薬プロセスの初期段階での特性評価を改善する革新的な技術が求められています。米国FDAは、薬剤の安全性を確保するための化合物試験ガイドラインを策定しており、心臓のhERGチャネルを阻害するなどのオフターゲット作用によって、torsades de pointesのような症状を引き起こし、市場から薬剤が撤退される事態を防ぐことを目的としています。この取り組みは「包括的in vitro不整脈アッセイ（CiPAプロジェクト）」と呼ばれています。
人工多能性幹細胞（iPSC）由来心筋細胞は、心機能および安全性に対する化合物の影響を評価するためのin vitroモデルとして非常に有用です。カルシウムシグナルの振動は細胞質内カルシウム濃度の変化を反映しており、EarlyTox 心毒性キットのようなカルシウム感受性色素を用いることで測定が可能です。ScreenWorks® Peak Proソフトウェアは、ピーク頻度、振幅の10%でのピーク幅などのパラメータを解析し、ハイスループットスクリーニング形式で心筋細胞に対する化合物の影響を特性評価します。
Cellular Dynamics International社は、従来のiPSCよりも凍結からの回復が早い改良型iPSC由来心筋細胞を開発しました。この改良により、FLIPR® Tetra ハイスループットセルベーススクリーニングシステム上で拍動する心筋細胞のカルシウムトランジェントに対する化合物の影響をスクリーニングする際の培養期間が5〜7日短縮され、ワークフローが改善されます。図1にはサンプルワークフローが示されています。本研究では、hERGチャネルに干渉することが知られている一部のがん治療薬を含む化合物の試験について説明します。
図1. FLIPR Tetraシステムを用いたiPSC²心筋細胞アッセイワークフロー。カルシウムオシレーションの変化を測定。
材料
- 細胞、プレーティング培地、維持培地を含むiCell®心筋細胞2キット（Cellular Dynamics,International）
- 0.1% (w/v) ゼラチン
- 384ウェル黒色透明底プレート（Corning）
- EarlyTox 心毒性キット(モレキュラーデバイス PN R8210)
- 試験化合物およびDMSO(Sigma Aldrich)
- FLIPR Tetraシステム（モレキュラーデバイス）
iCell Cardiomyocytes²によるプレート準備
iCell Cardiomyocytes²ユーザーガイドに従い、384ウェル黒色・透明底プレートを0.1%ゼラチンでコーティングしました。細胞は解凍後、25 µLの播種用培地にて8,000細胞/ウェルで播種されました。細胞は37°C、5% CO₂、100%湿度で24時間培養され、単層を形成した後、播種用培地をメンテナンス培地に交換しました。以降、メンテナンス培地は隔日で交換されました。5日目には細胞が同期して振動し、アッセイに使用可能な状態となりました。
スクリーニング用プレートの準備
スクリーニング用には、化合物原液を100% DMSO中で10 mMに調製し、メンテナンス培地中で10〜100 µMの試験溶液を作成しました。これらの溶液は、FLIPR Tetraシステムでの測定の24時間前にウェルに添加されました。培地中の最終DMSO濃度は0.15%（v/v）でした。化合物は30または100 µMの濃度範囲で、1/2ログ希釈にて、重複（n=2）または三重複（n=3）で試験されました。
FLIPR Tetraシステムによるカルシウムオシレーションの観察
アッセイの24時間前に、最終濃度30 µMから開始する1/2ログ希釈の化合物をメディア交換とともにiPSC Cardiomyocytes²に添加しました。アッセイの2時間前には、メンテナンス培地中のEarlyTox 心毒性色素を2倍濃度で25 µL添加し、37°C、5% CO₂でインキュベートしました。細胞のオシレーションに伴うカルシウム濃度変化による蛍光変化は、インキュベーターから取り出した直後にFLIPR Tetraシステムで測定されました。ScreenWorksソフトウェアの読み取りプロトコールで使用された設定パラメータは表1に示されています。データはScreenWorks Peak Proソフトウェアモジュールで解析され、グラフはGraphPad Prism 6で作成されました。
| モード | 設定 |
|---|---|
|
LED励起波長 |
515-575 nm |
|
フィルター発光波長 |
515-575 nm |
|
LED強度 |
50% |
|
カメラゲイン |
80 |
|
露光時間 |
0.05 second |
|
読み取り間隔 |
0.125 second |
表1. FLIPR Tetraシステムの読み取りパラメータ
心筋細胞のオシレーションピークパラメータに対する化合物の影響
化合物添加から24時間後のカルシウムオシレーションは、FLIPR Tetraシステムを用いて測定されました。iPSC2細胞は、従来のiPSCと同様にギャップ結合を形成し、同期してオシレーションすることで、カルシウム感受性色素によるピーク頻度の測定が可能です。iPSC2細胞は従来の細胞よりも4〜5日早くアッセイに使用可能となり、汚染リスクの低減と全体的な期間短縮により、スクリーニングワークフローが改善されました。
今回評価された化合物には、抗がん剤であるスニチニブ、イマチニブ、スタウロスポリン（毒性のため臨床使用されていないキナーゼ阻害剤）、ブスルファン（アルキルスルホン酸）、ドキソルビシン（アントラサイクリン系）、エトポシド（トポイソメラーゼII阻害剤）、パクリタキセル（細胞内チューブリン産生に干渉）などが含まれます。化合物添加から24時間後、一部のカルシウムオシレーションパターンはコントロールと大きく異なりました（図2）。スニチニブはオシレーション速度が遅く、ピーク高さの10%でのピーク幅がコントロールよりも大きくなりました。イマチニブおよびスタウロスポリンも同様のパターンを示し、これら3つの化合物はhERGチャネルの阻害と関連しています。hERGは心拍の回復に関与するカリウムチャネルをコードする遺伝子群であり、QT延長症候群やtorsades de pointes症候群の原因となる可能性があります。一方、パクリタキセル、ブスルファン、エトポシドはhERG活性が知られておらず、カルシウムオシレーションの遅延やピーク幅の増加は見られませんでした。濃度依存性の応答曲線では、ドキソルビシンおよびスニチニブによるピーク頻度の低下が示されました。パクリタキセルはピーク頻度に影響を与えない化合物の一例です（図3）。
抗がん剤に加えて、hERG阻害が知られている化合物として、抗精神病薬でドーパミン受容体遮断薬のドロペリドール、三環系抗うつ薬でセロトニン受容体阻害薬のアミトリプチリン、制酸薬のシサプリドがアッセイで評価されました。これら3つの化合物をiPSC²細胞に24時間添加したところ、いずれもピーク頻度の低下およびピーク高さの10%でのピーク幅の増加が観察されました（図4）。カルシウムオシレーションアッセイで評価された全化合物のIC₅₀値の概要は表2に示されています。
| 試験化合物 | 作用機序 |
ピーク周波数 IC50 (µM) |
|---|---|---|
| スニチニブ | キナーゼ阻害剤 | 0.58 |
| スニチニブ | キナーゼ阻害剤 | 0.61 |
| スタウロスポリン | キナーゼ阻害剤 | 4.02 |
| ドキソルビシン | アントラサイクリン | 51.8 |
| シサプリド | 制酸剤 | 0.01 |
| ドロペリドール | ドパミン拮抗薬 | 0.2 |
| アミトリプチリン | セロトニン拮抗薬 | 1.68 |
| パクリタキセ | チューブリン形成を阻害 | >100 |
| ブルスファン・アルキルスルホン | アルキルスルホン酸塩 | >100 |
| エトポシド | トポイソメラーゼII阻害剤 | >100 |
| ヘキソールシノール | 防腐剤 | >100 |
表2. iPSC²心筋細胞におけるカルシウムオシレーションに対する化合物の影響
図2. iPSC2心筋細胞におけるカルシウムオシレーション (A) FLIPR Tetraシステムで測定したコントロールのカルシウムオシレーション (B) iPSC2細胞に1 µMスニチニブを24時間曝露した後のカルシウムオシレーション (C) iPSC2細胞に1 µMパクリタキセルを24時間曝露した後のカルシウムオシレーション (D) iPSC2細胞に1 µMドキソルビシンを24時間曝露した後のカルシウムオシレーション
図3. 心筋細胞の振動ピークパラメータに対する抗がん剤の影響 (A) スニチニブ、ドキソルビシン、パクリタキセルを濃度依存的に24時間曝露した後のiPSC2細胞におけるカルシウムオシレーションのピーク頻度（BPM）ノート：パクリタキセルはピーク頻度の低下を示しませんでした (B) スニチニブ濃度の増加に伴うピーク高さ10%でのピーク幅の増加
図4. オシレーションするiPSC心筋細胞に24時間曝露した後のhERG阻害化合物のピークパラメータへの影響 (A) 1 µMシサプリド曝露後のカルシウムオシレーションパターン (B) ドロペリドール、アミトリプチリン、シサプリド曝露後のピーク頻度 (C) ピーク高さ10%でのピーク幅の増加
結論
iPSC²心筋細胞は、細胞解凍後4〜5日でカルシウムオシレーションアッセイをFLIPR Tetraシステム上で実施可能となり、従来の10〜14日と比較してスクリーニングワークフローを大幅に改善しました。ScreenWorks Peak Proソフトウェアは、オシレーションパターンの解析を容易に行い、心筋細胞に対する化合物の影響を明確に示す効率的なツールとして、創薬スクリーニングプロセスに貢献します。本アッセイは、創薬プロセスの初期段階で実施可能であり、心臓に対して潜在的に有害または有益な影響を持つ化合物をリード化合物選定前に特定するのに役立ちます。
参考資料
- Sirenko, Oksana, et al. "Phenotypic Assays for Characterizing Compound Effects on Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids". ASSAY and Drug Development Technologies, vol. 15, no. 6, 2017, pp.280-296., doi:10.1089/adt.2017.792.
- Sirenko, Oksana, et al. "In vitro cardiotoxicity assessment of environmental chemicals using an organotypic human induced pluripotent stem cell-Derived model.". Toxicology and Applied Pharmacology, vol. 322, 2017, pp.60-74., doi:10.1016/j.taap.2017.02.020.
- Sirenko, Oksana, et al. "Assessment of beating parameters in human induced pluripotent stem cells enables quantitative in vitro screening for cardiotoxicity.". Toxicology and Applied Pharmacology, vol. 273, no. 3, 2013, pp.500-507., doi:10.1016/j.taap.2013.09.017
- “iCell Cardiomyocytes² User Guide.” Cellular Dynamics International, Aug 2016
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