Application Note シンプルなスクラッチアッセイとタイムラプスイメージングによる細胞遊走の測定

はじめに

Jayne Hesley｜イメージングアプリケーションサイエンティスト｜Molecular Devices社

細胞の遊走は、血管新生、胚発生、癌転移、免疫応答、創傷治癒の生理学的メカニズムを解明するために長い間研究されてきました。このアプリケーションでは、生細胞単層層における人工「創傷」の閉鎖を測定するための、シンプルで中～ハイスループットの創傷治癒アッセイについて説明する。このアッセイを96ウェルマイクロプレートで実施することにより、1回の管理された実験において、適切な複製を持つ複数の化合物を試験することができる。このアッセイでは、細胞の増殖、遊走、拡散のすべてが、細胞が傷を閉じる能力に寄与した。透過光または生細胞対応蛍光を用いた自動化タイムラプスイメージングにより、「治癒」の進行を測定する手段が提供された。各時点の画像はハイコンテント画像解析ソフトウエアで対物レンズ解析が可能であり、データを時系列としてプロットしたり、特異性のある時点で個別に評価することができる。

方法

以下の実験では、細胞を96ウェルポリスチレンイメージングプレートに、インキュベーターで一晩培養後コンフルエンスに達するように最適化した濃度でプレーティングした。細胞密度40,000個/ウェルで2つの細胞株を用いた：HT1080ヒト線維肉腫とU2OSヒト骨肉腫。細胞を一晩接着させた後、20µLの使い捨てピペットチップ12本を手動マルチチャンネルピペッターにセットし、ウェルの各列を上から下へしっかりとドラッグして、同時に各単層の表面に薄い傷をつけた。プレートを光学顕微鏡で検査し、均一なスクラッチを確認した後、培地を吸引し、培地で調製した200μLの化合物を添加する前に、200μLの温DPBSでウェルを1回洗浄した。HT1080細胞株は、化合物処理時に100 nM siRactin（Spirochrome）を添加して標識した。U2OS細胞株は、すでにRFP-アクチンを発現するように安定的にトランスフェクトされていた。マイクロプレートは、環境制御と透過光オプションを備えたImageXpress Micro 4システムにセットした。 プレートは4倍の対物レンズを用い、透過光、RFP、siR-actin適合性の蛍光波長で1視野/ウェルを20時間毎、さらに22時間毎に自動的にイメージングした。タイムラプスイメージング後、プレートを4％ホルムアルデヒドで固定した。別のプロトコールとして、マイクロプレートを撮像し、次の時点までインキュベーターに戻し、再度撮像して前の読み取りに追加することで、「不連続」タイムラプスを構築することもできる。

タイムラプス画像は、あらかじめ設定された透過光セグメンテーションアルゴリズムを使用するカスタムモジュール、または細胞のアクチン染色に蛍光イメージセグメンテーションを使用するモジュールを使用して、MetaXpress®ソフトウェアで解析した。

スクラッチの開口面積を測定するために透過光を使用する

対物レンズが4倍あれば、96ウェルプレートの中心近くに注意深く傷をつければ、1視野でウェルの広い範囲を画像化できる（図1）。最も時間を節約するために、プレート内のすべてのウェルを事前に素早く読み取り、タイムラプス実験中に、通過可能な傷を含むウェルだけを画像化することができる。

図1.スクラッチ後0時間目に、プレートのサムネイルをモンタージュすることで、ウェル間のワインディングの効率と均一性を評価できる。緑色で輪郭を描いたウェルは、傷が不完全または見逃されているため、解析から除外した。

透過光画像はMetaXpress®ソフトウェアでのセグメンテーションに適しており、単純な透過光モジュールを使用してセルを同定し、細胞で覆われたウェルの面積を計算するか、コントラストが低い画像や多数のアーチファクトがある画像の場合は、カスタムモジュールエディターツールボックスから画像処理とフィルタリングのステップを追加して、開創面積の正確な測定を可能にする（図2）。 各細胞タイプについて蛍光画像も取得し、これらの実験での透過光画像を用いた解析結果は満足のいくものであったが、蛍光データは示していない。

図2. A. 上の画像は、代表的な3つのタイムポイントにおいて、4倍の対物レンズで透過光とTRITC（アクチン-RFP用）の両方で取得した接着U2OS細胞のオーバーレイを示す： 100nMコルヒチン処理後1時間、11時間、23時間。B. 真ん中のパネルは、MetaXpress®ソフトウェアの透過光（セルB）セグメンテーションモジュールを用いて生成したマスクを示す。黄色の領域がセルとして同定され、黄色のマスク下の総面積が報告されている。C.下のパネルは、細胞のない領域を識別するためにカスタムモジュールを使用して生成された水色のマスクである。計算結果をマスク画像に重ね合わせ、スクラッチ面積の経時的減少を示す。

各治療の平均データを時間に対してプロットすることで、スクラッチ領域への細胞遊走の進行を示すことができる（図3と4）。どのウェルも、単一波長または取得した波長のオーバーレイを使用して、簡単にムービーに変換することもできる。

図3.スクラッチ領域に遊走するコントロールと処理したU2OS細胞の進行を20時間にわたってプロットしたデータ。左のグラフは、透過光画像から求めた、細胞で覆われたウェルの総面積を単純に計算した結果である。細胞の総面積は、細胞遊走に対する化合物処理の効果に応じて、様々な速度で経時的に増加する。右のグラフは、創傷面積の減少によって測定された創傷の閉鎖を示す。 このグラフは、図2で見た画像セグメンテーション画像と相関している。両方の解析から、コルヒチンは細胞の遊走を有意に阻害すると結論づけることができる。

図4. スクラッチに遊走するコントロールと処理したHT1080細胞の進行を示すために、20時間にわたってプロットしたデータ。左のグラフは、透過光イメージングから求めた、細胞で覆われたウェルの総面積を単純に計算した結果である。 細胞総面積は、細胞遊走に対する化合物処理の効果に応じて、様々な速度で経時的に増加する。右のグラフは、創傷面積の減少によって測定された創傷の閉鎖を示す。両方の解析から、コルヒチンは細胞の遊走を有意に阻害すると結論できる。

異なる細胞タイプを使用して有効な結果を得る

Transmitted Light Analysis Module for Cell Type B（より大きな細胞用に最適化されている）を使用することで、HT1080とU2OSの両方の細胞の結果が生成された。 両方の細胞タイプのタイムラプスデータは、画像の目視評価と相関していた。

主要なタイムポイントのみを取得することで、時間とストレージ容量を節約

マルチユーザー環境では、長時間のタイムラプス実験がインストゥルメンテーションを独占し、他の研究者のアッセイを妨げる可能性がある。MetaXpress画像解析ソフトウェアバージョン6.5の不連続タイムラプス機能を使えば、生細胞のプレートをインキュベーターから取り出し、必要なときに画像取得し、個々の取得を1つの実験に追加してシームレスなタイムラプス解析を行うことができる（図5）。これによって、セルがスクラッチに完全に遊走するのに何日もかかるような場合に、余計なデータが多く生成されることもなくなる。また、マルチウェルマイクロプレートでタイムラプスアッセイを実行する場合、データベースの容量を節約することができる。

図5. 不連続タイムラプス取得はバーコードを入力することで行う。有効化すると、すべてのタイムポイントがバーコードを封じ込めた同じファイルに追加され、標準的なタイムラプス実験として収集されたかのようにまとめて解析することができる。

96ウェルにわたる20以上のタイムポイントの解析を完了するにはかなりの時間がかかるが、複数のコンピュータコアの並列処理を利用するMetaXpress PowerCoreで解析を実行することにより、解析は最大10倍速く完了する。

結論

ImageXpress Microシステムにより、研究者はコンフルエントな細胞単層に "wounding"（傷をつけること）してできた無細胞領域への細胞の遊走を経時的に定量することができる。タイムラプス画像は、決められた間隔で自動的に取得することも、プレートをインストゥルメンテーションから出し入れして手動で取得することもできる。例えば、インストゥルメンテーションが生細胞イメージングを維持するために必要な環境制御オプションを備えていない場合や、長時間のタイムラプス実験中に他のユーザーも同じインストゥルメンテーションで画像を取得する必要がある場合などである。インストゥルメンテーションは、低密度（12-48ウェル）組織培養プレートまたは96ウェルマイクロプレートで、2X-10Xの低倍率対物レンズを使用して行うスクラッチアッセイに対応し、複数の視野が必要な場合は、ソフトウェアでサイトをつなぎ合わせることができる。統合されたMetaXpress®画像解析ソフトウェアは、透過光または蛍光イメージの解析を提供し、細胞で覆われた単純な面積から、傷の幅や傷の面積のようなより複雑な測定値までのデータを生成します。

図6. 6つのタイムポイントを様々な間隔で取得し、A) 開いた傷の面積、B) 細胞で覆われたウェルの面積を分析した。どちらの解析も透過光画像を用いて行った。どちらの場合も、コルヒチンが傷口への細胞の遊走を遅らせたことは明らかである。