Application Note SpectraMax Miniマルチモードマイクロプレートリーダーで
デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を測定します。

はじめに

Cathy Olsen, PhD | Sr. Applications Scientist | Molecular Devices

ホタルルシフェラーゼは、遺伝子の制御と機能を研究するために広く使われているレポーターである。哺乳類の細胞や組織には内因性のルシフェラーゼ活性がないため、非常に感度の高いレポーターである。ホタルルシフェラーゼは62kDaのタンパク質であり、単量体として活性を示し、活性のためにその後のプロセシングを必要としない。D-ルシフェリンのATP依存的酸化を触媒し、その結果発光する（図1A）。ウミシイタケ（Renilla reniformis）由来のルシフェラーゼは、トランスフェクション効率を標準化するためのセカンドレポーターとして、また遺伝子の制御や機能を研究するためのセカンドレポーターとして、マルチプレックスルシフェラーゼアッセイによく用いられる。レニラ・ルシフェラーゼは、酸素によるコエレテラジン酸化を触媒して光を生成する（図1B）。

均質な試薬セット（Dual-Glo® Luciferase Assay System）により、ホタルとレニラの両方のルシフェラーゼ活性を1つのサンプルで測定することができ、ホタルは実験レポーターとして、レニラはコントロールとして作用する。ここでは、アッセイの性能と感度を評価するために、トランスフェクト済み細胞サンプルを用いてアッセイをセットアップした。どちらのルシフェラーゼ反応も、Molecular Devices SpectraMax® Miniマルチモードマイクロプレートリーダーで簡単に測定でき、SoftMax Pro® ソフトウェアを用いてレシオメトリックデータ解析を行うことができます。

材料

• Dual-Glo® Luciferase Assay System (Promega cat. #E2920)
• HeLa細胞 (ATCC cat. #CCL-2)
• pGL4.13[luc2/SV40] ホタルルシフェラーゼ発現ベクター (Promega cat. #E668A)
• pGL4.75[hRluc/CMV] レニラルシフェラーゼ発現ベクター (Promega cat. #E693A)
• ViaFect™トランスフェクション試薬 (プロメガ社 cat. #E4981)
• Opti-MEM 還元血清培地 (ThermoFisher Scientific cat. #31985062)
• Passive Lysis Buffer（プロメガ社、商品番号1941）
• ソリッド白色96ウェルマイクロプレート（Greiner cat.）
• SpectraMax Mini マルチモードマイクロプレートリーダー (Molecular Devices)
• 発光フィルターキューブ（Molecular Devices P/N 5089334）

細胞ベースデュアルルシフェラーゼアッセイ

細胞トランスフェクション

HeLa細胞を6ウェル組織培養処理プレートに1ウェルあたり2x105細胞で播種し、トランスフェクションの前に37℃/5% CO2で24時間インキュベートした。pGL4.13[luc2/SV40]ホタルルシフェラーゼ発現ベクターをOpti-MEM培地で1μg/μLに希釈し、pGL4.75[hRluc/CMV]レニラルシフェラーゼ発現ベクターを100ng/μLに希釈した。3本のチューブを以下のようにセットし、穏やかに混合した： 400μLのOpti-MEM培地＋2μL（2μg）のpGL4.13[luc2/SV40]ホタルルシフェラーゼ発現ベクター＋2μL（2ng）のpGL4.75[hRluc/CMV]レニラルシフェラーゼ発現ベクター。各チューブに6μLのViaFect試薬を加え、内容物をタッピングして穏やかに混合した。チューブを室温で10分間インキュベートし、複合体を形成させた。トランスフェクション複合体200μLを6ウェルプレートの各ウェルに滴下し、軽く振り混ぜた。

トランスフェクション後、セルを37℃/5% CO2で48時間インキュベートし、アッセイのために細胞を回収した。

セルサンプルの調製

機器性能の試験に適した細胞サンプルは、以下のように調製した。6ウェルプレート中のトランスフェクト細胞をトリプシン処理し、数を数え、約60,000個ずつのアリコートに分けた。次にセルを1500rpmで5分間スピンダウンし、PBSで1回洗浄した。PBSを除去し、細胞ペレットをアッセイ時まで-80℃で保存した。

既知数のトランスフェクト細胞からなる細胞溶解液を調製するために、凍結した細胞のアリコートを室温まで解凍し、150μLのPassive Lysis Bufferを加え、ピペッティングで静かに上下させることにより溶解し、次いで室温で15分間インキュベートして完全に溶解させた。細胞溶解液を450μLの細胞培養液で希釈し、約105個/mLの細胞を封じ込めた。この細胞溶解液から、一連の1:2希釈液を培地で作製した。

アッセイのセットアップ

細胞溶解液の各希釈液75μLを、96ウェル白色プレートのトリプリケートウェルにピペッティングした。ブランクとして、培地または緩衝液のみを封じ込めた。

75μLのDual-Glo Luciferase Assay Reagentを各アッセイウェルに添加し、プレートを室温で10分間インキュベートした後、SpectraMax Miniリーダーで0.5秒の積分時間を用いてホタル発光を測定した。次に75μLのDual-Glo Stop & Glo試薬を発光アッセイウェルに添加し、プレートを室温で10分間インキュベートした後、SpectraMax® Miniリーダーで0.5秒の積分時間でレニラ発光を測定した。

SoftMax® Proソフトウェアを用いてデータを解析し、グラフ化した。各サンプルのホタルルシフェラーゼの測定発光量（相対発光量、RLU）を、対応するレニラの測定値で割って、正規化シグナルを算出した。

代表的データ

図2は、トランスフェクタントしたHeLa細胞で検出されたホタルおよびレニラ・ルシフェラーゼの代表プロットを示す。これらの結果は、Dual-Gloアッセイを用いると、1ウェルあたり20セル未満で両方のルシフェラーゼを検出できることを示している。ホタルとレニラのルシフェラーゼ活性の正規化（図 3）は、細胞数やウェル間のレポーター遺伝子トランスフェクション効率などの実験変動性の補正に役立つ。SpectraMax Mini リーダーは発光感度が高く、ルシフェラーゼアッセイの出力を簡単に検出できるため、さまざまな実験ワークフローが可能であり、SoftMax Pro ソフトウェアを用いたデータ解析も容易である。