Application Note SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーで
細胞溶解液中の総タンパク質量測定

最小限のインキュベーション時間でタンパク質濃度を正確に測定
8チャンネルリードヘッドで結果を素早く取得
SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルを使用して、標準曲線をプロットし、サンプルのタンパク質濃度を自動計算

PDF版（英語）

はじめに

Joyce Itatani｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Cathy Olsen, PhD｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

細胞溶解液からのタンパク質濃度の定量は、ウェスタンブロットや酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）など、多くのダウンストリームアプリケーションにとって重要なステップです。最もポピュラーな2つのアッセイは比色分析で、タンパク質の存在下での試薬の色の変化に依存します。ブラッドフォードタンパク質アッセイは、クマシーブルー色素の465nm（未結合）から595nm（結合）への吸光度シフトに基づいています。(1)タンパク質はCu²⁺をCu¹⁺に還元し、(2)ビシンコニン酸はCu¹⁺に結合し、562nmで光を強く吸収する紫色の複合体を形成します。

ここでは、細胞溶解液中の総タンパク質を定量するためのPierce Rapid Gold BCAアッセイとPierce Detergent Compatible Bradfordアッセイの使用法についてご説明します。標準的なBCAアッセイは37℃で30分のインキュベーションを必要とするが、Rapid Gold BCAアッセイは室温で5分のインキュベーションで済み、吸光度は480nmで測定されます。 Detergent Compatible Bradfordアッセイは、界面活性剤を含むバッファーで溶解した細胞にクマシー色素を使用した場合に発生する問題を克服しています。

どちらのアッセイもSpectraMax® ABS Plusマイクロプレートリーダーで読み取りました。SoftMax® Proソフトウェアであらかじめ設定されたプロトコルを用いてデータを取得し、そこから細胞溶解液の濃度を決定するstandard curveをplotした。Rapid Gold BCAアッセイと界面活性剤適合Bradfordアッセイのいずれも、使用した細胞溶解液で同様の結果が得られました。

材料

Pierce Rapid Gold BCAタンパク質アッセイキット (ThermoFisher)
Pierce Detergent Compatible Bradfordアッセイキット (ThermoFisher)
RIPA Buffer (ThermoFisher)
ハルトプロテアーゼ阻害剤シングルユースカクテル (ThermoFisher)
グライナー透明96ウェルマイクロプレート（Greiner Bio-One）
CHO-K1細胞（ATCC）
SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

SpectraMax ABSおよびSpectraMax PLUS 384マイクロプレートリーダーでも同様の結果が得られます。

方法

細胞溶解液の調整

CHO-K1細胞のT-75フラスコから培地を吸引し、細胞をカルシウムとマグネシウムを含む10mLのcold PBSで洗浄しました。PBSを吸引した後、2mLのRIPA緩衝液をフラスコに加え、細胞を室温で5分間インキュベートして完全に溶解させました。Haltプロテアーゼ阻害剤を最終濃度1Xで細胞溶解液に加えました。細胞溶解液を分割し、1.5mLの微量遠心管2本に移し、14,000rpmで20分間遠心しました。上清の1:3希釈系列をPBSで調製し、細胞と溶解バッファー濃度の範囲でアッセイの性能をテストしました。

Standard curves

両タンパク質アッセイとも、ウシ血清アルブミン（BSA）標準品を25μg/mLから2000μg/mLの範囲で、アッセイキットの説明書に従って調製しました。

Rapid Gold BCAアッセイ

20μLのBSA標準液または細胞溶解液を96ウェルマイクロプレート（n = 3）の各ウェルにピペッティングし、続いて200μLの作業試薬（50:1試薬A:試薬B）を加えました。プレートを 30 秒間振とう機にかけて混合し、室温で 5 分間振とうせずにインキュベートしました。SpectraMax ABS Plusプレートリーダーで480nmの吸光度を読み取りました。

Detergent Compatible Bradfordアッセイ

10µLのBSA標準液または細胞溶解液を96ウェルマイクロプレート（n = 3）の各ウェルにピペッティングしました。各ウェルに300μLのDetergent Compatible Bradfordアッセイを加えました。ウェルの内容物を上下に数回ピペッティングして混合しました。プレートを室温で10分間インキュベートし、SpectraMax ABS Plusプレートリーダーで595 nmで読み取りました。

データ分析

標準曲線はSoftMax Proソフトウェアのquadratic curve fitを用いてplotし、細胞溶解液の濃度はソフトウェアにより standard curveから算出した。

結果

Rapid Gold BCA および Detergent Compatible Bradfordアッセイ用の BSA 標準曲線を図 1 に示します。SoftMax Proソフトウェアは、各アッセイの標準曲線から細胞溶解液濃度を自動的に算出しました。

図1. BCA Rapid Goldアッセイ（赤プロット、r2 = 1.000）およびDetergent Compatible Bradfordアッセイ（青プロット、r2 = 0.999）のBSA standard curve。

Sample	Wells	Dilution Factor	OD Value	Concentration	Mean Conc	SD	CV	AdjConc
01	E1 F1 G1	1.000	0.355 0.996 0.403	239.916 692.080 272.547	401.514	252.166	62.8	401.514
02	E2 F2 G2	3.000	0.395 0.356 0.322	266.970 240.998 218.043	242.004	24.479	10.1	726.011
03	E3 F3 G3	9.000	0.151 0.124 0.116	103.796 85.800 80.931	90.176	12.004	13.4	811.580
04	E4 F4 G4	27.000	0.044 0.039 0.030	33.386 30.517 24.327	29.410	4.630	15.7	794.073

平均調整結果：683.3 図2. Rapid Gold BCAアッセイの結果。SoftMax Proソフトウェアのデータテーブルは、連続希釈した細胞溶解液の計算濃度を示しています。

Sample	Wells	Dilution Factor	OD Value	Concentration	Mean Conc	SD	CV	AdjConc
01	E1 F1 G1	1.000	0.224 0.225 0.188	216.035 216.679 178.309	203.674	21.969	10.8	203.674
02	E2 F2 G2	3.000	0.217 0.225 0.251	208.432 217.537 245.221	223.730	19.160	8.6	671.190
03	E3 F3 G3	9.000	0.117 0.111 0.107	104.006 98.128 94.286	98.806	4.895	5.0	889.258
04	E4 F4 G4	27.000	0.050 0.051 0.039	37.286 38.564 27.182	34.344	6.235	18.2	927.291

平均調整結果：672.9 図3. Bradford assayの結果。SoftMax® Proソフトウェアのデータテーブルは、Detergent Compatible Bradfordアッセイによる細胞溶解液の計算濃度を示しています。

結論

Pierce Rapid Gold BCA および Pierce Detergent Compatible protein assay は、長時間のインキュベーションや溶解液中の洗剤の影響を気にすることなく、細胞溶解液サンプル中の総タンパク質を簡単に定量する方法をご提供します。Rapid Gold BCAアッセイでは、より直線的な標準曲線が得られ、希釈した細胞溶解液の範囲にわたってより一貫した結果が得られますが、全体的な結果はどちらのキットも同様でした。

SoftMax Proソフトウェア搭載のSpectraMax ABS Plusプレートリーダーは、standard curveをプロットし、サンプル濃度を自動計算する設定済みプロトコルを備え、データ収集・解析のための完全なソリューションをご提供します。Speed Read設定により、96ウェルプレートをわずか5秒で読み取ることができ、タンパク質の定量プロセスがさらに効率化されます。

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