Application Note EarlyToxセルインテグリティキットによる
細胞生存率と細胞毒性測定

高いシグナルにより露光時間が短縮され、迅速な結果が得られる
多くの細胞種に対応する設計
単一システムで画像取得と解析を合理化

PDF版（英語）

はじめに

EarlyTox細胞完全性アッセイキットは、生細胞と死細胞の同定を簡便化する最適化された試薬セットです。細胞生存率に対する様々な処理の効果を測定し、アポトーシスやネクローシスを含む様々なメカニズムを介した毒性効果を評価するために使用できます。このキットは、接着細胞、非接着細胞を問わず、多くの細胞種で使用できるように設計されている。プロトコールはシンプルなワークフローと試薬の性能により、ハイスループットスクリーニングに適している。

このアッセイでは、2種類のDNA結合色素、セル透過性のLive Red Dyeとセル不透過性のDead Green Dyeを使用する。Live Red Dyeは、細胞膜の完全性に関係なく、すべての細胞の核に入り、明るい赤色の蛍光シグナルを発する。Dead Green Dyeは、細胞膜が損なわれた死細胞のみに入り、明るい緑色の蛍光シグナルを発する（図1）。生細胞イメージングシステムによって検出された蛍光シグナルに基づいて、生細胞と死細胞を容易に識別することができる。

図1. EarlyTox Cell Integrity Kitの測定原理。アッセイに使用する2種類の色素の特性により、生細胞と死細胞を区別できる。ライブレッド色素はすべての細胞に入り込み、核を赤色に染色します。一方、デッドグリーン色素は膜が損傷した細胞にのみ入り込み、核を緑色に染色します。赤色蛍光のみを示すセルは生細胞として検出・識別され、赤色蛍光と緑色蛍光の両方を示すセルは死細胞として識別される。

SpectraMax® MiniMax™ 300イメージングサイトメーターとSoftMax® Proソフトウェアは、EarlyToxセルインテグリティキットを補う完全なイメージングおよびデータ解析パッケージを提供します。インストゥルメンテーションの2色蛍光イメージャー機能とソフトウェアの細胞解析機能を使用すると、96ウェルプレートの細胞生存率を5分未満で評価できます。

EarlyTox セルインテグリティーアッセイのセットアップ

HeLa細胞を384ウェル黒壁透明底マイクロプレートに1ウェル当たり5000細胞播種した。細胞を24時間接着させ増殖させた後、細胞毒性化合物をウェルに添加した。化合物処理24時間後、EarlyTox Cell Integrity Kitを用いて、製品添付文書に従って細胞生存率を評価した。このアッセイはホモジニアス形式で実施できるため、細胞の損失や不正確な結果を引き起こす可能性のある培地除去や洗浄のステップを省くことができます。オプションのマスキング試薬を使用することで、培地や試験化合物によるバックグラウンドを低減することができる。

結果

SpectraMax® MiniMax® 300イメージングサイトメーターで、緑（541 nmエミッション）および赤（713 nmエミッション）チャンネルを使用して、セルをイメージングした（図2A）。赤色チャンネルで対物レンズのサイズと閾値を設定することにより、画像中のすべての細胞核を自動的に同定した。細胞は、ソフトウェアのClassification機能を使って生細胞か死細胞かをカウントした。Classification機能は、赤のみにラベル付けされた核と、赤と緑にラベル付けされた核を区別することができる（図2B）。ソフトウェアが提供する出力パラメーターの詳細なセットには、各ウェルの生細胞のパーセンテージが含まれる。IC50曲線は、SoftMax Proソフトウェアの4パラメータカーブフィットを用いてプロットした（図3）。

図2. 未処理および化合物処理したHeLa細胞の分析。A. 未処理細胞（左パネル）はほとんどが生きており、核は赤色蛍光を発する。中間濃度の化合物（中央パネル）では、生細胞と死細胞が混在している。高濃度の化合物（右パネル）では、ほとんどのセルが死んでおり、核は赤と緑の両方で標識されている。画像はSpectraMax® MiniMax® 300イメージングサイトメーターで取得した。B. SoftMax® ProソフトウェアのClassification機能を用いて、セルを生細胞（赤色マスク）または死細胞（青色マスク）に識別した。

図3. 細胞毒性化合物のIC50曲線。HeLa細胞をアニソマイシン（赤丸）またはスタウロスポリン（青四角）で処理した。結果は、SoftMax® Proソフトウェアの4パラメータカーブフィットを用いてプロットした。アニソマイシンのIC50は3.3 µM、スタウロスポリンのIC50は0.53 µMであった；両値とも公表値と一致した。

結論

SpectraMax MiniMaxイメージングサイトメーターと併用することで、EarlyTox細胞完全性アッセイキットは、蛍光イメージングによる生細胞集団と死細胞集団を簡便に測定できる。様々な細胞毒性メカニズムを介した細胞毒性を容易にモニタリングし、定量化することができます。SoftMax Proソフトウェアは、生細胞と死細胞の染色パターンを区別し、結果を自動的にプロットするため、解析時間を節約できます。

注文情報
試薬	商品説明	品番
arlyTox セルインテグリティキット	(2) 試薬バイアル（赤、緑各1本） ** 96または384ウェルプレート（2枚）分	R8213
アーリートックスセルインテグリティーキット	(2) 試薬バイアル（赤、緑各1本） ** 96または384ウェルプレート（10枚）分	R8214
EarlyToxライブグリーン色素	(1）試薬バイアル ** 96または384ウェルプレート2枚分	R8215
EarlyToxデッドグリーン色素	(1）試薬バイアル ** 96または384ウェルプレート2枚分	R8216
アーリートックス生赤色素	(1）試薬バイアル ** 96または384ウェルプレート2枚分	R8217