Application Note ハイコンテントイメージング対応
プレートリーダーでのマーカー発現測定

  • イメージングサイトメトリー機能を搭載したプレートリーダーで広がるアプリケーション
  • 細胞単位またはウェル単位でマーカー発現レベルを簡単に測定
  • 従来のマイクロプレートリーダーのワークフローに準拠
  • 細胞の可視化によるデータ出力の信頼性向上
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はじめに

細胞タンパク質の有無は、刺激への反応、分化の状態、特定の細胞タイプの特徴、または遺伝子導入の成功を示すことがあります。例えば、血管細胞接着分子-1（VCAM-1）の表面発現は、通常、正常な血管内皮には存在しませんが、サイトカインTNF-αによってin vitroで刺激され、炎症反応を引き起こすことがあります。このような細胞内のタンパク質発現は、イメージングサイトメトリーを用いることで容易に可視化し、定量化できます。

細胞におけるマーカー発現の定量測定

ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を96ウェルプレートで48時間培養し、その後、抗炎症化合物SB202およびSB203をさまざまな濃度で2時間処理しました。処理後、VCAM-1発現をTNF-αで24時間刺激しました。細胞は4％パラホルムアルデヒドで固定し、抗VCAM蛍光抗体で染色しました。イメージングは、SpectraMax® i3 マルチモードプレートリーダーのフィールドアップグレードオプションである SpectraMax® MiniMax™ イメージングサイトメーターを使用して取得しました。画像解析はSoftMax® ProソフトウェアのMarker Expressionプロトコールでリアルタイムに実行しました。化合物の効果は、SoftMax Proソフトウェアで作成した用量反応曲線により評価し、抗炎症化合物がサイトカイン刺激から細胞を保護し、VCAM-1発現を抑制できたかどうかを確認しました。

VCAM-1発現レベルは、低い背景蛍光を除去するための強度しきい値と、スクラッチやほこり、気泡などの微小なアーティファクトを除去するためのサイズしきい値を設定して定量化しました。図1は、SoftMax ProソフトウェアでMarker Expressionプロトコールを視覚的に設定する様子を示しています。

図1. プレート読み取り前の陽性および陰性サンプルの解析パラメーターのテスト。SoftMax® Proソフトウェアのインターフェースには、画像セグメンテーションに最適なパラメータを設定するためのビジュアルコンポーネントがいくつか用意されています： 1: バックグラウンド強度と対物レンズサイズの閾値を調整し、蛍光セルを識別します。2: 陽性ウェルと陰性ウェルのセグメンテーションマスクを表示して、さらに調整が必要かどうかを確認します。3: 棒グラフに見られるように、陽性ウェルと陰性ウェルで大きな差が得られる出力パラメーターを選択します。Marker Expression Protocolは、フルオレセイン標識抗VCAM抗体で標識されたセル領域を同定するために使用します。VCAM-1の存在は、炎症反応が陽性であることを示す。

図1. プレートリード前に陽性および陰性サンプルで解析パラメータをテスト SoftMax Proソフトウェアのインターフェースには、画像セグメンテーションの最適なパラメータ設定を支援する視覚的コンポーネントがあります。
1: 蛍光細胞を識別するために背景強度とオブジェクトサイズのしきい値を調整。
2: 陽性および陰性ウェルのセグメンテーションマスクを表示し、さらなる調整が必要か確認。
3: バーグラフで陽性と陰性ウェル間の差が大きくなる出力パラメータを選択。
Marker Expressionプロトコールは、蛍光抗VCAM抗体で標識された細胞領域を識別します。VCAM-1の存在は炎症反応が陽性であることを示します。

固定された細胞は、蛍光抗VCAM抗体で染色され、Marker Expressionプロトコールで識別されます。細胞はほぼコンフルエントであるため、プロトコールは個々の細胞をセグメント化するのではなく、視野全体でのマーカー発現を測定するように設定されています。

図2. 抗炎症性化合物による治療に対する細胞の反応。左の画像は蛍光イメージャーVCAM-1を発現している細胞を示し、右の紫色のマスクは炎症マーカーを示す細胞のセグメンテーションを示している。高用量の抗炎症化合物SB202で処理したセル（上段）はVCAM-1をほとんど発現していないが、非常に低用量のSB202で処理したセル（下段）はサイトカインで刺激され、大量のVCAM-1を発現した。値は正規化した総シグナル強度で示した。

図2. 抗炎症化合物処理に対する細胞応答 左側の画像は蛍光VCAM-1発現を示し、右側の紫色マスクは炎症マーカーを示す細胞のセグメンテーションを示します。抗炎症化合物SB202の高用量で処理された細胞（上段）はVCAM-1発現がほとんど見られませんが、非常に低用量で処理された細胞（下段）はサイトカインによって刺激され、大量のVCAM-1を発現しました。値は正規化された総シグナル強度で示されています。

図3. マーカー発現結果の解析。上：プレートテンプレートの注釈付きウェル。下： 平均マーカー発現量と化合物濃度のプロット。抗炎症化合物の濃度が高くなるにつれて、サイトカイン刺激によるVCAM-1発現量は減少する。正規化された全シグナル強度は、多くのカーブフィット処理オプションの一つでプロットすることができ、IC50濃度を決定することができる。SB202 IC50= 0.1 µM、SB203 IC50=1.8 µM。

図3. マーカー発現結果の解析
上: プレートテンプレート内のアノテーション付きウェル。
下: 平均マーカー発現と化合物濃度のプロット。抗炎症化合物の濃度が増加すると、サイトカイン刺激によるVCAM-1発現量は減少します。正規化された総シグナル強度は、さまざまなカーブフィットオプションでプロットでき、IC₅₀濃度を算出できます。SB202 IC₅₀ = 0.1 µM、SB203 IC₅₀ = 1.8 µM。

マーカー発現アッセイから得られるさらなる情報

SpectraMax MiniMax イメージングサイトメーターは、ウェル内の単純な蛍光強度を超えた視覚化と情報を提供します。測定された蛍光領域は、目的のマーカーを発現する細胞に局在し、広い視野により多数の細胞を一度に解析できます。SoftMax Proソフトウェアを用いた直感的な解析により、用量反応曲線のプロットやIC₅₀値の算出が可能です。これらを総合すると、MiniMax イメージングサイトメーターは細胞イメージングを簡素化し、細胞におけるマーカー発現測定のための標準的なプレートリーダーアッセイを補完する結果を提供します。

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