Application Note ImageXpressマイクロハイコンテントイメージャーシステムを用いた
ミトコンドリアの形状と分布の測定

PDF版（英語）

はじめに

ミトコンドリアの応答を評価することは、細胞の健康に対する化学物質の特異性を決定するためにしばしば用いらます。これらの応答は、MitoTracker™色素のような蛍光インジケータの強度によって示されるように、ミトコンドリアが安定した膜電位を維持する能力を含むことがあります。その他の測定可能な反応としては、細胞内のオルガネラの形態や分布の変化があります。

ハイコンテントイメージャーでは、マイクロプレート内で培養・処理した細胞を、洗浄工程なしに生きたままイメージングすることができ、最も自然な状態の細胞をリアルタイムで研究することができます。高倍率、共焦点光学系、Zプレーンの収集を組み合わせることで、3D画像を生成し、その後3Dボリュームとして解析できるため、すべての細胞から得られる情報量が大幅に増加します。

これらのアッセイは、ImageXpress® マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムとMetaXpress® ハイコンテント画像解析ソフトウェアを用いて、自動化されたスクリーニング環境で行うことができます。

材料

MitoTracker Orange CMTMRos（Life Technologies P/N M7510）
WI-38ヒト肺線維芽細胞（P12）
ロテノン
クロロキン
384ウェル黒色透明底マイクロプレート（BD Falcon P/N 353962）
ヘキスト33342核染色
ImageXpress Micro Confocalハイコンテントイメージングシステム

アッセイ方法

WI-38細胞を384ウェル組織培養処理マイクロプレートに1ウェルあたり50μL、7,500個プレーティングしました。37℃、5％CO2インキュベーター内で30分間接着させました。その後、ウェルを3つの異なる濃度のロテノンまたはクロロキンで30分間処理しました。最後に、6倍濃度のMitoTracker Orange + Hoechstを各ウェルに10μLずつ加え、最終濃度を100nMのミトコンドリア色素と5μMのHoechstとしました。90分間のインキュベーション後、プレートをImageXpress® Micro ConfocalシステムでDAPIおよびTRITCフィルターセットを用い、40Xまたは60X Plan Apo対物レンズでイメージングしました（図1）。

***図1. 60X対物レンズで撮影した生の2Dプロジェクション画像。
50 μMロテノン（上）とクロロキン（下）で処理した細胞のミトコンドリア。

データ解析

ImageXpress®マイクロ共焦点システムでイメージングされた細胞は、MetaXpress®ソフトウェアで3D解析モジュールを用いて可視化され、解析されました。段階的なユーザー入力により、モジュールは核を正確にセグメンテーションし、ミトコンドリアを凝縮型か伸長型かに分類するだけでなく、ミトコンドリアの総個体数に関する測定値を出力し、ミトコンドリアの個別の形態に関する測定値を提供します。zシリーズからの3Dレンダリングにより、画像セグメンテーションマスクが生画像の対象オブジェクトを正確に識別していることを確認できるだけでなく、解析の対象となる形態学的および空間的パラメーターを強調表示することができます。

***図2. 染色したミトコンドリア（赤）と核（白）の等値面オーバーレイの3Dレンダリング。(左）*
50 μMロテノン処理細胞は凝縮を示し、核に近接しています。(右）クロロキン処理細胞は、細胞全体に広がった細長いミトコンドリアを示します。

結果

このアッセイにより、クロロキン処理細胞は、対照細胞で認められた細長い形態と凝縮した形態の比率を維持しながら、ミトコンドリアの体積が増加していることが示されました。ロテノン処理細胞は、コントロールと比較して、総容積の減少および凝縮ミトコンドリアの比率の増加によって示されるミトコンドリアの凝縮を示しました。

ImageXpress マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムとMetaXpress ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア（3D解析モジュール）の組み合わせにより、複数の細胞内ミトコンドリアの反応を迅速かつロバストに定量化することができます。