Application Note SpectraMaxマイクロプレートリーダーによる活性酸素種の測定

はじめに

活性酸素種（ROS）は、酸素を封じ込めた化学的に反応性の分子です。真核生物では、これらの分子は主に好気呼吸中に生成され、DNA損傷や脂質過酸化などの問題を引き起こし、細胞障害をもたらします。活性酸素はまた、アポトーシス、細胞の老化、細胞シグナル伝達にも関与しています *1, *2。当然のことながら、細胞は還元酵素や抗酸化物質によってこれらの酸化種から身を守っているが、処理しきれないほどの活性酸素が蓄積すると、細胞は酸化ストレス状態に移行します。したがって、細胞の活性酸素レベルを正確に測定することは、活性酸素が細胞生物学や生理全般で果たす役割を理解する上で非常に重要です。

最も一般的に研究されている活性酸素には、スーパーオキシド（O₂）、ヒドロキシラジカル（-OH）、過酸化水素（H₂O₂）などがあり、これらは細胞膜、ミトコンドリア、その他の小器官で代謝副産物として産生されます *3 。H₂O₂は半減期が長く、細胞透過性が高いため、活性酸素アッセイでは一般的に測定されます。さらに、活性酸素の一部は無毒化の過程でH₂O₂に変換されるため、酸化ストレスの優れた指標となります。

このアプリケーションノートでは、SpectraMax® マイクロプレートリーダーを使用して、発光ベースのアッセイを用いて活性酸素レベルを正確に定量する方法を示します。最初の実験では、無益な酸化還元サイクルとそれに続く活性酸素の蓄積を引き起こす合成化合物であるメナジオンで処理した細胞の活性酸素レベルを測定するために、プレートリーダーをどのように使用できるかを示しています *4。2番目の実験では、発光アッセイをモレキュラーデバイス EarlyTox® Live/Deadアッセイキットとマルチプレックスし、活性酸素蓄積と細胞生存率の関係を調べました。

材料

• HepG2 細胞（ATCC）
• 完全増殖培地
  ◦最小必須培地 (Corning)
  ◦ウシ胎児血清 (Gemini)
  ◦ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（Thermo Fisher Scientific）
• 試験化合物
  ◦サポニン (Sigma) 
  ◦メナジオン（Sigma）
• マイクロプレート
  ◦96ウェル黒壁透明底組織培養処理マイクロプレート（Corning）
  ◦96ウェル白色組織培養処理透明底マイクロプレート（Corning）
  ◦96ウェルソリッド白色マイクロプレート (Greiner)
• ROS-Glo H 2 O 2 アッセイ（Promega）
• EarlyTox Live/Deadアッセイキット（モレキュラーデバイス、カタログ番号R8340）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）
• SpectraMax Lマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

方法

HepG2細胞を96ウェル白底透明プレートに10,000細胞/ウェルでプレーティングし、37℃で一晩培養しました。試験化合物メナジオンを330 µMから1:3希釈系列で細胞に添加し、25 µMのROS-Glo H₂O₂基材を加えました。その後、細胞を37℃で2時間インキュベートしました。その後、等容量のROS-Glo 検出液を処理ウェルに添加し、プレートを室温で20分間インキュベートしました。SpectraMax i3xプレートリーダーおよびSpectraMax Lプレートリーダーで発光を読み取りました。データはSoftMax® Proソフトウェアで解析し、4パラメータカーブフィットを用いてグラフ化しました。

2番目のアッセイでは、HepG2細胞を96ウェルクリアボトム黒壁プレートに10,000細胞/ウェルでプレーティングし、37℃で一晩インキュベートしました。次に細胞を0.25μMメナジオンまたは0.2%サポニン（1xPBSで希釈）で処理しました。試験化合物添加と同時に、25μM ROS-Glo H₂O₂基材20μLを細胞に添加しました。2時間培養後、各ウェルから50µLの処理細胞培養液を、50µLのROS-Glo検出溶液を封入したソリッド白色96ウェルプレートに移しました。プレートを20分間インキュベートした後、SpectraMax i3xプレートリーダーで発光を測定しました。細胞を封じ込めた元のプレーティングプレートに、EarlyTox Live/Dead working solutionを50µL加え、細胞を室温で30分間インキュベートしました。その後、プレートをSpectraMax i3xリーダーで、EarlyTox Live/Dead Assay Kitの製品添付文書に記載されている蛍光設定を用いて読み取りました（設定済みプロトコルはSoftMax Proソフトウェアで利用可能）。データ解析とグラフ化はGraphPad Prismで行いました。

結果

メナジオンはミトコンドリアの電子伝達鎖を阻害し、活性酸素の蓄積を引き起こすことが知られています。メナジオンで処理したHepG2細胞は、濃度依存的に活性酸素の増加を示し、発光の増加で示されました（図1）。SpectraMax i3xプレートリーダーおよびSpectraMax Lプレートリーダーを用いてこれらのサンプルの発光を測定したところ、EC₅₀の計算値がそれぞれ13.0 μMおよび11.9 μMとなり、同様のデータが得られました。

図1. メナジオン用量反応曲線。HepG2細胞を330 µMから始まるメナジオン3倍希釈系列で処理し、ROS-Glo H₂O₂アッセイを用いて活性酸素レベルを測定しました。発光はSpectraMax i3xリーダー（上）とSpectraMax Lリーダー（下）で測定しました。算出されたEC₅₀値は、それぞれ13.0μMと11.9μMでした。

結論

SpectraMax i3x および SpectraMax L プレートリーダーは、ROS-Glo H₂O₂ アッセイによる正確な活性酸素測定を可能にします。さらに、SpectraMax i3x プレートリーダーのマルチモード機能により、マルチプレックスアッセイが可能になり、ウェル当たりにより多くのデータが得られます。ROSアッセイをEarlyTox Live/Dead Assayとマルチプレックスすることで、メナジオンで処理した細胞は高レベルのROSを示しましたが、サポニンで処理した細胞と比較して劇的な細胞死は示さなかったです。これらのアッセイを組み合わせることで、細胞毒性と活性酸素蓄積の関係をさらに調べることができます。データ解析と4-parameter curve fitの処理には、SoftMax Proソフトウェアを使用しました。マイクロプレートとリードハイトの最適化ウィザードは、最適なシグナル検出を保証します。

参考文献

1. Hancock, J. T., R. Desikan, and S. J. Neill. “Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways.” Biochemical Society Transactions 29.2 (2001): 345-349.
2. Lee, J., N. Koo, and D. B. Min. “Reactive oxygen species, aging, and antioxidative nutraceuticals.” Comprehensive reviews in food science and food safety 3.1 (2004): 21-33.
3. Turrens, Julio F. "Mitochondrial formation of reactive oxygen species.". The Journal of physiology 552.2 (2003)： 335-344
4. Criddle, David N., et al. "Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells.". Journal of Biological Chemistry 281.52 (2006)： 40485-40492.

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