Application Note GLP/GMP環境における比色測定法を用いた
マイクロプレートベースのエンドトキシン試験

はじめに

汚染物質のモニタリングは、製薬・医療機器産業における製造工程中の重要なステップである。頻繁に発生する汚染物質であるエンドトキシンは、発熱、炎症、頭痛、吐き気、そして死に至ることさえあります。グラム陰性菌の細胞壁に存在するエンドトキシンは、感度が高く特異的なLimulus Amebocyte Lysate (LAL)アッセイによって日常的に検出されている。エンドトキシンの存在下では、LALは酵素を介したカスケードによって凝固し、ゲル化と濁度に基づいて従来から定量されてきた。

アソシエイツ・オブ・ケープコッド社(ACC)のPyrochrome® アッセイには、パラニトロアニリン発色剤(pNA)を用いた合成基質が含まれており、分光光度法による定量が可能です。凝固酵素はエンドトキシンによって（間接的に）活性化される。酵素は基質を切断し、405nmで光を吸収するpNAを遊離する。吸光度（A405）はプレートリーダーで測定でき、サンプル中のエンドトキシン濃度に比例する。

FDA 21 CFR Part 11などの規制要件を満たすために、機器やソフトウェアを使用してデータを収集・保存している企業にとって、データの完全性を維持することは最優先事項です。収集、分析、プレゼンテーションのために複数のソフトウェアアプリケーション間でデータを転送することは、エラーを引き起こし、トレーサビリティを複雑にする可能性がある。また、複数のアプリケーションをサポートし、検証し、担当者を訓練するためには、さらなるオーバーヘッドが発生する。

Molecular Devices社製VersaMax™ Absorbance Microplate ReaderをPyrochromeアッセイに使用するためのバリデーションでは、SoftMax® Pro GxPソフトウェアを用いてデータの取得と解析を行いました。

SoftMax Proソフトウェアでは、Pyrochromeアッセイやその他のACCアッセイ用に特別に作成された設定済みのメソッドプロトコールが利用でき、合否判定基準を自動化するための内蔵分析ツールを活用できます。さらに、SoftMax Pro GxPソフトウェアの機能には、データの読み取り、設定や計算式の変更、ファイルへの電子署名を行うためのユーザー割り当て権限レベルが含まれており、GLP/GMPガイドラインをサポートしています。

このアプリケーションノートでは、パイロクロムアッセイにおける標準曲線の典型的なセットアップについて説明します。発色試験は VersaMax 吸光度マイクロプレートリーダーを用いて実施した。データは SoftMax Pro GxP ソフトウェアを用いて解析し、グラフ化した。

材料

• VersaMaxマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製品型番：VERSAMAX）
• SoftMax Pro GxPソフトウェアバージョン5.4（Molecular Devices社カタログ番号SMP54-GXP- 10UL）
• パイロクロムアッセイ発色試験試薬 (ACC cat. #C1500)
• コントロール標準エンドトキシン (ACC cat. #E010)
• パイロプレート96ウェルマイクロプレート（ACC cat. #CA961型

方法

マイクロプレートに試薬を分注する前に、VersaMaxリーダーの電源を入れ、SoftMax Pro GxPソフトウェアを起動した。

SoftMax Pro GxPソフトウェアのドロップダウンメニューから "Pyrochrome Kinetic "メソッドプロトコルを選択すると、画面上に新しいデータファイルが作成された。

• 検査および試薬の情報は、指定された[メモ]セクションにいつでも入力できます。テキストの入力や計算式の変更は、ユーザー権限によって異なります。
• 適切なユーザー権限があれば、検体をプレートレイアウトに割り当てるPlate Templateをいつでも変更して、プレート内の適切な向きを反映させることができます。SoftMax Pro GxPソフトウェアの設定と計算には、対応する権限がユーザーに割り当てられていないとアクセスできません。

インキュベーターの温度は37℃に設定した。

パイロクロムアッセイ試薬を3.2mLの再構成バッファーで再構成し、過度の発泡と感度の低下を避けるため、穏やかに旋回させながら混合した。

コントロール標準エンドトキシン溶液の一連の希釈液をLAL試薬水で調製した。標準液および曲線作成に使用した最終濃度は、50、5、0.5、0.05および0.005 EU/mLであった。各希釈系列から50µLを3連で96ウェルPyroplate®マイクロプレートに移した。

• LAL 試薬水 50 µL の陰性対照を 3 回に分けてプレートに添加した。
• 50μLの再構成パイロクロムアッセイ試薬を各ウェルにできるだけ速やかに添加した（リピーティングピペットを使用することもできる）

注：あるいは、標準品とライセートの比率を1：1に保ちながら、各標準品／対照品を100 µLずつ使用することもできます。

マイクロプレートを直ちにマイクロプレートドロワーにセットし、SoftMax Pro GxPソフトウェアの "Read "ボタンをクリックして測定プロセスを開始した。その後、ソフトウエアは以下のことを自動的に実行した：

• 読み取りに先立ち、独自のオートミックスモーションにより、各ウェルの内容物が飛散することなく完全に混合された。
• 405nmの吸光度データを10～15秒ごとに1時間かけて取得し、リアルタイムで表示する。インターバルと実行時間は、特定の試薬ロット番号の推奨インキュベーション時間に従って調整できる。
• 各ウェルのオンセット時間、すなわち各ウェルが指定された光学濃度（OD）閾値に達するまでの時間を計算するために、自動データ削減が適用された。指定されたオンセットODは0.03に設定されたが、変更可能である。
• 少なくとも3つの標準品（USP/FDA準拠）の濃度について、得られたオンセット時間を用いて対数標準曲線を作成した。

注：グラフを自動入力するには、プレートテンプレートでウェルの割り当てを行う必要があります。

• 勾配、y 切片、相関係数はグラフの凡例と結果の要約セクションで報告した。

結果

VersaMax Microplate Readerがパイロクロムアッセイに適していることを示すために、濃度の対数に対して平均オンセット時間（秒）の対数をプロットして標準曲線を作成した（図1）

標準曲線は3つの点で注目に値する：高いr2係数（0.992）、複製の標準偏差の小ささ（y-エラーバー）、パイロクロムアッセイの最高感度（0.005 EU/mL）に達するVersaMaxリーダーの能力。

SoftMax Pro GxPソフトウェアのメソッドプロトコールは、個々のアッセイの妥当性を決定するために使用される結果に自動的にフラグを立てるようにも設計されています：

• 相関係数｜r｜の絶対値は少なくとも0.980でなければならない。
• 陽性製品コントロールは、相当する標準品の公称濃度の50～200％以内であること。
• 陰性コントロールのエンドトキシン濃度（標準曲線の外挿により決定）は、最低標準濃度のエンドトキシン濃度よりかなり低いこと。

結論

レプリカ間のばらつきが少なく、アッセイで規定された検出下限値までの感度を持つ直線標準曲線の作成は、試験サンプル中のエンドトキシンを検出するためのVersaMaxマイクロプレートリーダーとパイロクロムアッセイの性能を実証しています。比色変化の結果、SoftMax Pro GxPソフトウェアはオンセット時間に基づいて標準曲線から未知検体のエンドトキシン濃度を自動的に補間します。補間は、標準曲線のオンセット平均時間の範囲内に制限することができます。

SoftMax Pro GxP Softwareのデータファイルで実行されたすべての作業は監査で追跡されますが、結果がレビューされた後、電子署名を行うことで、割り当てられた権限に関係なく、それ以降の変更に対してファイルをロックすることができます。複数の署名フィールドが用意されており、レビュアーや承認者など、さまざまな役割を示すことができます。

PyrochromeアッセイとVersaMaxマイクロプレートリーダーは、生産工程におけるエンドトキシン汚染を検出するための高感度で特異的な方法を提供します。VersaMax Readerと一緒に使用するSoftMax Pro GxP Softwareのオールインワンのデータ取得と解析は、解析と報告のために複数のソフトウェアパッケージ間でデータを転送することに伴うリスクとコストを最小限に抑えます。

SoftMax Pro GxPソフトウェアには、電子記録に関するFDA 21 CFR Part 11などの規制の下でのGLP/GMPコンプライアンスを支援する追加機能があり、許可されたユーザーの権限を制御してデータの整合性を維持し、重要なアクションのトレーサビリティを確立します。

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