Application Note SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーでエンドトキシンをモニタリング

はじめに

Joyce Itatani ｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Cathy Olsen｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

汚染物質のモニタリングは、医薬品・医療機器業界の製造プロセスにおいて非常に重要なステップです。頻繁に発生する汚染物質であるエンドトキシンは、発熱、炎症、頭痛、吐き気、そして死に至ることさえあります。グラム陰性菌の細胞壁に存在するエンドトキシンは、感度が高く特異性の高いLimulus amebocyte lysate (LAL)アッセイを用いて日常的に検出されています。エンドトキシンの存在下では、カブトガニのLimulus polyphemusから得られたLALは、酵素を介したカスケードによって凝固し、ゲル凝固、比濁、比色分析によって定量することができます。

LonzaのPYROGENT™-5000カイネティックLALアッセイは、LAL凝固を経時的な濁度の増加としてモニターするカイネティックアッセイで、吸光プレートリーダーでカイネティックに測定することができます。最初にエンドトキシンが多く存在するほど、オンセット時間（反応時間とも呼ばれる）、すなわちサンプルの吸光度が初期値より一定量増加するのに必要な時間が短くなります。サンプル中に存在するエンドトキシンの量を計算するために、オンセット時間対標準濃度の標準曲線を作成。このアッセイは、0.001～10エンドトキシン単位（EU）/mLのエンドトキシンレベルの検出に使用できます。

材料

• PYROGENT-5000 カイネティックLALアッセイ（Lonza)
• 96-well 透明 LAL Reagent Grade™ マルチウェルプレート（Lonza）
• パイロジェンフリー希釈チューブ（Lonza）
• LAL試薬水（Lonza）
• SpectraMax® ABS Plusマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）

方法

SpectraMax ABS Plus プレートリーダーを37℃に加温してからアッセイを開始。

試薬の再構成

• コントロールスタンダードエンドトキシン（CSE）を、キットに同梱の分析証明書に記載された容量のLAL試薬水（LRW）で再構成し、100 EU/mLの溶液を得ました。バイアルを15分間ボルテックス。
• LAL試薬は、キットの説明書に従ってLAL Reconstitution Bufferで再構成。

標準曲線

• 100.0 EU/mL エンドトキシン原液 0.1 ml を LAL 試薬水 0.9 ml に加え、10.0 EU/mL エンドトキシンを封じ込めた溶液を調製。
• 10EU/mL標準品から始まり0.001EU/mL標準品で終わる1:10希釈系列を標準曲線用にLRWで作製。
• 各エンドトキシン標準物質100 μLをLAL試薬グレードマルチウェルプレートのトリプリケートウェルに添加。
• マイクロプレート（標準物質を封入）を、予熱したSpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダー内で37℃で10分間インキュベート。
• その後、100 uLのLAL試薬をエンドトキシン標準物質を含むウェルに添加し、SoftMax® Proソフトウェアで事前に設定したカイネティック比濁LALプロトコルを用いて、表1に示す装置設定で直ちにカイネティック測定を開始。

表1. SpectraMax ABS Plusプレートリーダーでのカイネティック比濁アッセイの設定。SoftMax Proソフトウェアのカイネティック比濁LALプロトコルには、最適な設定が含まれており、結果の自動分析が可能です。(平均値＝平均オンセット時間）

データ解析

SoftMax ProソフトウェアのData Reductionダイアログでは、パラメータは以下を除きデフォルト値に設定しました：

• 最初のデータポイントをゼロに設定
• カイネティックリダクション： オンセット時間、オンセットOD 0.03の場合

平均オンセット時間をソフトウェアで計算し、エンドトキシン標準濃度に対してプロットしました。

結果

0.001～10EU/mLの代表的な標準物質のカイネティックトレースを図1に示し、オンセット時間を赤の縦線で示しました。SoftMax Proソフトウェアにより、各標準物質の平均オンセット時間を標準物質濃度に対してプロットしました（図2）。

図1. 代表的な標準物質のカイネティックトレース。赤の縦線はオンセット時間を示します（オンセットOD = 0.03）。

図2. エンドトキシン標準曲線。SoftMax Proソフトウェアのlog-logカーブフィット処理を用いて、平均オンセット時間（秒）対エンドトキシン標準濃度をプロット（n = 3、r2 = 0.996）。

PYROGENT-5000アッセイマニュアルによると、性能要件は以下の通りです：

• 算出された標準曲線の相関係数（r）の絶対値は 0.980 以上。
• レプリケートの反応時間の%C.V.が 10%未満。

SpectraMax ABS Plus プレートリーダーを用いて作成した標準曲線では、r=0.998 であり、要求値の 0.980 を超えています。SoftMax Proソフトウェアで計算したトリプリケートの標準物質の%C.V.は、各標準物質で10%未満でした（表2）。SpectraMax Plus 384マイクロプレートリーダーを使用しても同等の結果が得られました（データは示していません）。

表2. SoftMax Proソフトウェアの標準物質群テーブルで計算された値。各標準物質の%C.V.は10%未満であり、PYROGENT-5000アッセイキットのマニュアルに示された必要な再現性を満たしていました。

結論

細胞溶解液(LAL)試験は、米国薬局方(USP)により、多くの医薬品および医療機器製品のエンドトキシンレベルを測定するために認められています。定量的、カイネティックPYROGENT-5000アッセイは、エンドトキシンレベルを確認するためのハイスループットな方法を提供し、0.001 EU/mLという低レベルを検出することができます。SpectraMax ABS PlusリーダーとSoftMax Proソフトウェアは、PYROGENT-5000アッセイとともに、SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルを使用した結果の自動計算により、エンドトキシン検査の合理化されたワークフローを提供します。