Application Note ヒト心筋細胞におけるBNP発現と細胞サイズの
モニタリングによる肥大反応の評価
- 形態の変化を可視化
- 複数の肥大パラメーターを一度に定量化
- 96ウェルおよび384ウェルプレートで心筋細胞をスクリーニングすることで、スループットを最大化
- アダプターを用いた統計的に有意なサンプル数の収集
PDF版（英語）
はじめに
心筋肥大は、心筋梗塞、虚血、高血圧、弁機能障害など多くの心疾患に関連する病態であり、環境汚染物質や医薬品候補化合物の毒性副作用としても観察されます。心筋肥大は、細胞サイズの増大やタンパク質合成の亢進といったさまざまな細胞変化を特徴とします。心筋肥大の古典的なバイオマーカーの一つがB型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）で、肥大化した心筋細胞において過剰に産生されることが知られています *1。
人工多能性幹細胞（iPSC）由来の心筋細胞をハイコンテントイメージングアッセイでモニタリングすることにより、化合物の毒性またはスクリーニングのエンドポイントとして、肥大の発症または改善をそれぞれハイスループットで測定することができます。したがって、これらのアッセイは、薬理試験や疾患モデリングによる医薬品開発の両方で使用される表現型スクリーニングプロセスにとって、頑健かつ有用なツールです *2。
以下の実験では、ヒトiPS細胞由来のiCell®心筋細胞（Cellular Dynamics Intl. これらの細胞は、生来の心筋細胞の生化学的、電気生理学的、力学的、病態生理学的特性を再現することが示されており、エンドセリン-1（ET-1）で細胞を誘導することにより、肥大の疾患モデルが作成されました。肥大を抑制する化合物の有効性は、自動化されたImageXpress® Micro ハイコンテントスクリーニングシステムとMetaXpress® ソフトウェアを用いて定量化し、BNP発現と細胞面積を測定しました *2。
ハイコンテントスクリーニング用アッセイ
心筋肥大をアッセイするための詳細なプロトコール *1は、Cellular Dynamics Internationalから入手できます。ハイコンテントスクリーニングに対応しやすい一般的なワークフローを図1に示します。総反応量は384ウェルプレートで通常40μLでした。
図1. ハイコンテントイメージングと解析によるスクリーニングのアッセイワークフロー。
データ収集はImageXpress Micro システムで行いました。画像は2つの異なる波長（DAPIとCy5フィルターを使用）で10倍または20倍の倍率で収集され、384ウェルプレートの1ウェルあたり1000個以上の細胞を調べるのに十分な部位を自動的に収集するための適応的収集が行われました。データ解析はMetaXpress ソフトウェアのMulti-Wavelength Cell Scoring Moduleを用いて行いました。
心筋肥大に関連する分子および細胞バイオマーカーのハイスループットスクリーニング
化合物の毒性による病的な心筋肥大は、多くの分子的・細胞的変化によって特徴づけられます。ヒト心筋細胞におけるこれらの変化を捉えることは簡単であり、ハイスループットのワークフローに適合します。以下の例は、分子および細胞肥大バイオマーカーの測定を例証するものです。
分子バイオマーカーの変化の定量化
BNPの増加は、心筋肥大時に発現が変化する多くのタンパク質の一つです。ここでは、蛍光抗体でBNPを標識して細胞質のBNP染色を測定することにより、ハイコンテントイメージングを用いてBNPの発現を決定しました（図2A）。この実験では、iCell心筋細胞をET-1の10倍希釈系列で処理しました。化合物処理の対数濃度に対して細胞あたりのBNPシグナルをプロットすることにより、心筋細胞におけるET-1誘導BNP発現の用量反応曲線を作成しました（図2B）。次に、ET-1の用量反応からEC50値を生成するために、この曲線を適合させました。
図2A. ET-1添加前後のiCell心筋細胞におけるBNP発現。未処理のiCell心筋細胞（左）または10nM ET-1で18時間刺激したiCell心筋細胞（右）の画像。細胞はBNP発現を検出する抗体（赤）で標識し、核はHoechst 33342（青）で染色した。画像は20倍の倍率で取得しました。BNPシグナルの面積からBNP発現レベルを算出しました *1。
図2B. この代表的な384ウェル実験では、指示濃度のET-1で刺激した後、BNP発現の用量依存的増加が起こりました。ET-1のEC50値は24pMでした（平均±SEM；曲線上の各点についてn＝4）*1。
細胞サイズの変化の定量化
細胞サイズの増大とアクチン細胞骨格の構造的再編成は、肥大反応の細胞的特徴としてよく知られています *2。iCell心筋細胞をET-1で誘導し、染色した後、ImageXpress Micro システムで画像化しました。肥大した心筋細胞は、未処理の細胞よりも目に見えて大きくなっていました。細胞サイズの増大はMetaXpressソフトウェアを用いて定量化され（図3）、BNP検出の場合と同様のEC50値が得られました。
図3. 未処理（左）と10nM ET-1誘導（中）のiCell心筋細胞の画像は細胞サイズの違いを示しています。細胞体の大きさを決定するためにAlexa Fluor 488標識ファロイジンを用い（緑）、核はHoechst 33342で染色しました（青）。画像は20倍の倍率で取得しました。細胞サイズ（平方ミクロン）の変化は、EC50値11pM（平均±SEM；n=3）のET-1の滴定に対して定量化しました（右）*2。
早期創薬にハイスループットスクリーニングとヒト生物学を導入
肥大と心不全は創薬の一般的な治療領域である。ImageXpress Micro Systemのハイスループット機能とヒト幹細胞由来の組織細胞との組み合わせは、創薬スクリーニングの初期段階でヒト生物学にアクセスするための完全なシステムをご提供します。概念実証として、心筋細胞を各阻害剤の10ポイント用量で四重反復処理した後、1nM濃度のET-1で刺激しました。阻害活性を示した化合物のうち5つは、ベラパミル（カルシウム拮抗薬）、BEZ-235（P13K-mTOR二重阻害薬）、シクロスポリンA（カルシニューリン阻害薬／免疫抑制薬）、フェノフィブラート（高脂血症治療薬）、SAHA（幅広いヒストン脱アセチル化酵素阻害薬）*2 です（図4）。
図4. 複数の化合物プロファイリング実験から代表的なデータをプロットしました。 iCell心筋細胞を培養4日目に、ET-1（1 nM）で18時間肥大を誘導する前に、化合物の希釈系列で1時間処理しました（384ウェルフォーマット）。BNP発現の変化は、化合物の滴定に対して定量しました。ベラパミル（黒丸）が最も強力な阻害剤で、IC50値は35 nMでした *2。
サマリー
ヒトiPSC由来の心筋細胞は、心筋肥大をモデル化するためのin vitro細胞系をご提供します。これらの薬剤誘導心筋細胞をモニターするためにハイコンテントスクリーニングを用いることで、治療の副作用としての心筋肥大の測定が可能になるとともに、抗肥大化合物を試験するためのモデル系の構築が可能になります。BNP発現レベルや細胞サイズの変化のような複数のパラメーターを1つのアッセイで得ることができますので、肥大反応の微妙な指標も観察することができます。さらに、96ウェルおよび384ウェルアッセイフォーマットと、ImageXpress Micro ハイコンテントスクリーニングシステムおよびMetaXpress ソフトウェア Multi-Wavelength Cell Scoring Moduleを利用した自動イメージングおよび解析を組み合わせることにより、疾患モデル研究および薬理学的テストの両方において、マイクロプレートでの表現型スクリーニングが容易になります。
参考文献
- Modeling Cardiac Hypertrophy: Endothelin-1 Induction with High Content Analysis, iCell Cardiomyocytes Application Protocol, Cellular Dynamics International, January 2014. https://www.cellulardynamics.com/products/lit/CDI_iCellCM-Hypertrophy_ET1_HighContent_AP.pdf
- Phenotypic Screening with Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes: HTSCompatible Assays for Interrogating Cardiac Hypertrophy, Carlson, C., et al., J Biomol Screen, 2013, 18(10):1203-11, doi:10.1177/1087057113500812.
PDF版（英語）