Application Note インジェクターモジュール付きSpectraMax i3xリーダーで
Gqタンパク質共役型受容体の活性化をモニターする

はじめに

Gqタンパク質共役型レセプターの活性化は、一般的に、蛍光プ レートリーダー上のカルシウム感受性色素を用いて、生細胞でリ アルタイムにモニターされる。プレートリーダー内の自動リキッドハンドリングは、一般にアゴニスト化合物をマイクロプレート内のセルに供給するために必要であり、その間に検出システムは化合物による蛍光強度値の変化をリアルタイムで読み取る。得られたカイネティック測定の解析から、アゴニストやアンタゴニストのEC50値やIC50値など、化合物の反応プロファイルに関する情報が得られる。

このアプリケーションノートでは、SpectraMax®i3xマルチモードマイクロプレートリーダー（SpectraMaxインジェクターモジュール付き）を使用して、2つの異なる細胞株でカルシウムアッセイを行う方法について説明します。CHO M1WT3細胞は、M1ムスカリンGq共役型受容体を安定的にトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣細胞です。ヒト星細胞腫細胞株である1321N1は、内因性ムスカリン性コリン作動性受容体を発現している。SoftMax® Proソフトウェアを使用したデータ解析により、両細胞株について正確なEC50値およびIC50値が得られ、ハイスループットスクリーニングシステムを使用した以前の結果に匹敵する結果が得られました。ソフトウェアのグラフィカル・ユーザー・インターフェースであるAcquisition Editorは、アッセイのインジェクターと検出パラメーターのセットアップを容易にした（図1）。

材料

●CHO M1WT3セル（ATCC cat.）
●1321N1セル（ECACC cat.）
●アゴニスト化合物
　・塩化カルバモイルコリン（カルバコール；Sigma cat.）
　・塩化アセチルコリン（Sigma cat.）
●アンタゴニスト化合物
　・アトロピン（Sigma cat.）
●FLIPR ® カルシウム6アッセイキット（Molecular Devices社、カタログ番号R8190）
●1 M HEPES (Thermo cat. #15630-080)
●ReadiUse ™ 水溶性プロベネシド（AAT Bioquest社、商品番号20061）
●SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
　・SpectraMax インジェクターモジュール
●FlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダー

方法

セル調製

CHO M1WT3細胞を96ウェル黒壁透明底プレートに50,000 個／ウェル、100μLずつ播種した。37℃、5% CO2で一晩培養した。

1321N1セルを「アッセイレディ」試薬として使用した。手短に言えば、1バイアル分の凍結細胞（1mL当たり1,000万個）を37℃の水浴中で急速解凍し、10mLのDMEM培地に再懸濁した。細胞を1,000RPMで5分間遠心し、培地を捨て、新鮮なDMEMに1mL当たり30万個懸濁した。次に、黒壁透明底96ウェルプレートに、1ウェル当たり100μLで30,000個の細胞を播種した。37℃、5% CO2で一晩培養した。

両細胞株とも、カルシウムアッセイは細胞をマイクロプレートに播種した翌日に行った。

試薬の調製

29.4 mLの1X HBSSに0.6 mLの1M HEPESを加え、30 mLのアッセイバッファーを調製した。このアッセイバッファーは他のアッセイ試薬の調製に使用した。25mMプロベネシドストック溶液は、1バイアル分のプロベネシドを10mLのアッセイバッファーに溶解して作製した。25mMプロベネシド1mLとアッセイバッファー10mLからなる溶液を、色素ローディングバッファー（カルシウム6アッセイキットに付属）1バイアルを再構成するために使用し、バイアルを30秒間ボルテックスして混合した。

色素負荷

細胞を封じ込めたマイクロプレートの各ウェルに、100 µL の Dye Loading Buffer を添加した。その後、プレートを37℃、5% CO2で2時間インキュベートした。アッセイ前にセルは洗浄しなかった。

化合物の調製

アゴニストアッセイのために、カルバコール（CHO M1WT3細胞）またはアセチルコリン（1321N1細胞）の5倍ワーキングストックをアッセイバッファーで調製した。作業ストックの1:3希釈系列を4mLポリプロピレンチューブに入れた。各化合物について、8つの濃度からなる完全な濃度反応曲線を作成した。

拮抗薬のアトロピンは1：3希釈系列として調製した。ワーキングストックを適切な最終濃度になるようにアッセイプレートのウェルに加え、プレートを30分間平衡化した。その後、インジェクターを用いてEC80濃度のアゴニストをウェルに供給した。

細胞ベースアッセイのセットアップ

SpectraMax i3xリーダーを用い、SpectraMaxインジェクターモジュールでアゴニ スト濃度応答曲線を1化合物濃度ずつ測定した。各曲線について、キャリーオーバーを最小にするため、低濃度から高濃度へとアッセイを実行した。インジェクター1を化合物でプライミングし、色素をロードしたセルプレートをインストゥルメンテーションにセットし、3反復のアッセイを実行しました。各ウェルにつき、5X 化合物ワーキングストック 50 µL を、ウェル内の 200 µL のセル、培地、Dye Loading Buffer に注入し、最終的な化合物濃度を 1X とした。

その後、インジェクターを逆回転させてラインから化合物を除去し、次の高濃度の化合物でプライムした。新しいプレートセクションが作成され、アッセイは次の複製ウェルセットで実行された。このプロセスを各濃度の化合物について、濃度反応曲線が完成するまで繰り返し、各レプリケートセットごとに新しいプレートセクションを作成した。

SoftMax ProソフトウェアのAcquisition Planを使用して、装置とインジェクターの設定を定義した（図1）。

アンタゴニスト試験は、ダイローデッドセルを含むアッセイプレートのウェルにアンタゴニスト希釈系列を手動でプレーティングし、30分間平衡化した後、SpectraMax i3xリーダーでカイネティックアッセイを実行し、すべてのアッセイウェルに単一のEC80濃度のアゴニストを注入することにより行った。

対照として、同じ色素負荷細胞プレートの追加ウェル をFLEXStation 3Multi-Modeマイクロプレートリー ダーでアッセイした。FLEXStation 3Multi-Modeマイクロプレートリー ダーは、統合型マルチチャンネルピペッターを用いて化合物 をウェルに供給する。FlexStation 3リーダーの装置設定を表1に示す。

表1. カルシウム測定におけるFLEXstation 3リーダーの設定

結果

SpectraMax i3x リーダーでは、インジェクターモジュールを使用し て各化合物希釈液を別々のプレート読み取りステップで送 出することにより、一貫したアゴニスト濃度応答曲線が得られました。キャリーオーバーの問題を回避するため、化合物は低濃度から高濃度へと注入された。アンタゴニストアッセイは、セルとアンタゴニ スト化合物を封じ込めたウェルに、EC80 濃度のアゴニ ストを1回だけ注入するものであり、1回のプレート読み 取りで行われた。

アゴニストであるカルバコールは、SpectraMax i3xリーダーでは32.8 nM、FLEXstation 3リーダーでは21.7 nMのEC50値で、CHO M1WT3細胞に発現するM1ムスカリン受容体を活性化した（図2）。アトロピンはこの活性化に拮抗し、IC50値はそれぞれ0.54 nMと1.4 nMであった（図3）。1321N1細胞に発現するムスカリン性アセチルコリン受容体（mAChR）は、アセチルコリンによってEC50値0.50μMおよび0.24μMで活性化され（図4）、アトロピンによってIC50値0.24nMおよび0.62nMで拮抗された（図5）。表2は、両細胞株で得られた濃度応答値をまとめたものである。

表2. インジェクターモジュール付きSpectraMax i3xリーダーおよびFLEXstation 3リーダーで得られたEC50およびIC50値の要約。

結論

SpectraMax インジェクターモジュールを用いると、EC50値と IC50値が、ハイスループット・スクリーニング・システムで既 に発表された値とほぼ一致する濃度応答曲線が得られた。SoftMax ProソフトウェアのAcquisition Viewを使用することで、化合物の送達パラメーターとリアルタイムの細胞モニタリングが簡単に設定できました。インジェクターベースのシステムによる結果は、ピペッター搭載のFLEXstation 3リーダーやFLIPR Tetra® ハイスループット細胞スクリーニングシステムで取得されたデータとほぼ一致した。

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