Application Note β-カテニンモジュレーターの核転座スクリーニングアッセイ

はじめに

双極性障害（BD）は遺伝性の精神疾患で、世界人口の約1％が罹患しています。1949年に躁病の治療に初めて使用されたリチウムは、現在でも双極性障害の最も一般的な治療薬です。しかし、患者の50％はリチウム治療に反応せず、毒性と副作用が重大な問題となっています。

リチウムの作用機序の治療的基盤は完全には解明されていませんが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK-3）の活性を阻害し、Wntシグナル伝達経路を活性化することが知られていて、プロテアソームが介在するβ-カテニンの分解を直接的・間接的に低下させます。Wnt/β-カテニンシグナル伝達の新しいタンパク質や薬理学的調節因子は、細胞シグナリングに蓄積されたままのβ-カテニンの量によって測定されるβ-カテニン分解をブロックしたりブロック解除したりする能力に基づいて同定することができます。このような定量は、ハイスループットでシステマティックなイメージングアプローチによって合理化され、検出と解析が改善されます。この取り組みを支援するため、Wntシグナル伝達経路の破壊に応答して核内の ß-カテニン蓄積を測定できる細胞ベースのレポーターアッセイでハイコンテントスクリーニングプラットフォームを利用し、1856種類のヒト経験化合物のライブラリーをスクリーニングしました。

ハイスループットなワークフローのためのエンドポイントアッセイの準備

強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）と融合したヒトß-カテニンを発現するようエンジニアリングしたU2OS細胞を、384ウェルマイクロプレートに1500細胞/ウェルでプレーティング。細胞を37℃で48時間培養した後、スクリーニング・ライブラリーの化合物を添加しました。細胞をさらに24時間培養した後、5μg/mLのHoechst 33342 DNA色素を封じ込めた4%パラホルムアルデヒドを用いて固定。これらの結果に基づき、スクリーニングライブラリーから1つの活性化合物をさらに評価し、以下に示しました。

スピードを損なうことなく、統計的有意性の高い多数の細胞をイメージング

ハイコンテントイメージングは、ImageXpress® Microシステムを用いて実施した。EGFP蛍光とHoechst核染色を測定するために2つの Wavelengthを用い、10倍の対物レンズでウェルあたり4部位を取得。10倍の倍率は、各視野で1000以上の細胞のデータを取得し、一貫して統計的に有意な解析結果をもたらしました。

化合物刺激に対する表現型反応の同定

β-カテニン-EGFP発現細胞株を基礎条件下（コントロール）でイメージングしたところ、β-カテニン-EGFPレポーターのプロテアソームによる分解が恒常的に起こるため、細胞質にも核にもβ-カテニンは見られなかったです。その代わりに、細胞膜に残存するカドヘリンのサブ集団との相互作用による、かすかな膜局在シグナルが画像から明らかになりました（図2、左）。GSK-3β阻害剤などでWntシグナル伝達経路を阻害しますと、ß-カテニン-EGFPレポーターは用量依存的に核に集積しました（図2、右）。

インタラクティブでフレキシブルなソフトウェアを用いたデータ解析

MetaXpress®ソフトウェアのTranslocation-Enhanced Application Moduleを使用して、核を同定し、核に対する細胞内の異なるコンパートメントに存在するß-カテニン-EGFP蛍光の量を定量しました（図3）。

核コンパートメントのセグメンテーションは、Hoechst核色素で染色した領域から作成。この核マスクを第二の波長（EGFP）と併用し、アッセイの特異性に応じてサイズと幅を調整できるコンパートメントを作成しました。これにより、核、細胞質、細胞膜などの各コンパートメント内の蛍光強度を定量化し、解析することができます。インタラクティブなモジュールは、パラメーターが調整されると即座にフィードバックを与えるので、特異性アッセイごとに解析を微調整することができます。

MetaXpress®ソフトウェア トランスロケーションエンハンスドアプリケーションモジュールは、様々なアルゴリズムを使用して、セルがどのようにスコアされるかをカスタマイズすることができます。特定の細胞コンパートメントにおける各Wavelengthの平均強度または合計強度を細胞ごとまたは画像ごとに測定することに加えて、細胞領域全体における2つの染色の強度からピアソンの相関係数を計算することができます。結果として得られる係数は-1（反相関）から1（完全相関）までの範囲となります。この例では、係数が高いほど、より多くのß-カテニン-EGFPが核に転移していることを意味します（図4）。

低い核転座

高い核転座

その後、核コンパートメント対細胞質平均強度の比をプロットして用量反応曲線を作成（図5）。アッセイのロバスト性はZ'値を計算して評価しました。

転座イベントをハイスループットで測定

ß-カテニンのシグナル伝達経路を調節する化合物に反応してß-カテニンの転座を測定するこのアッセイは、細胞内転座イベントを検出するハイスループットなアッセイの一例である。低倍率でも高画質な画像により、化合物の活性を特徴付けるための統計学的に適切な測定値が得られ、アッセイされた多数の化合物から活性のある化合物が明確に同定された。細胞ベースレポータージーンアッセイと当社のハイコンテントスクリーニングフォームを組み合わせることで、ある細胞コンパートメントから別の細胞コンパートメントへのタンパク質のトランスロケーションのスクリーニングキャンペーンを成功させるための完全なソリューションを提供します。

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