Application Note PathCheckテクノロジーによる
1 cm光路長への自動補正付き光学濃度測定

はじめに

UV/VIS分光光度計とマイクロプレートリーダーは、ビーム形状が根本的に異なります。分光光度計では、サンプルは水平（断面）光路を持つcuvetteまたはチューブを通して読み取られます。水平な光ビームと標準的な1 cmの光路長により、消光係数に基づくアッセイが容易になり、研究室間での結果の比較も簡単に行えます。マイクロプレートリーダーでは、垂直光ビームの光路長は各ウェルの液量に依存します。

マイクロプレートでは光路長が変化するため、消光に基づく測定が難しく、マイクロプレートリーダーで得られた結果と分光光度計で得られた結果を比較するのが困難でした。この問題は、モレキュラーデバイスのPathCheck®テクノロジーの導入により改善されました。このテクノロジーは、マイクロプレートの各ウェルの光路長を決定し、吸光度値を1cmの光路長に自動的に正規化します。このアプリケーションノートでは、PathCheckテクノロジーの原理についてご説明し、SpectraMax® マイクロプレートリーダーおよびSoftMax Proソフトウェアでの具体的な使用方法をご紹介します。

PathCheckの原理

近赤外測定による光路長補正

水は基本的に200 nmから900 nmまで透明ですが、近赤外（NIR）では977 nm付近に特徴的な吸収ピークがあります（図1）。この特徴的な吸光度バンドは、ほとんどの生物製剤分子がほとんど吸光度を持たないスペクトル領域にあるため、水性サンプルを通過する光の光路長を測定するために利用することができます。

光の吸収に関するランベルトの法則は、吸光度は光が試料を通過する距離に比例すると予測しています。ベースライン吸光度は、水のピークから離れた波長、例えば900 nmで測定することができます。水性試料を通過する光の光路長は、マイクロプレートウェルで得られたピークの高さと、標準1cm cuvetteで得られたピークの高さを比較することで算出できます：

実際には、977 nm は光路長測定に理想的な波長ではありません。なぜなら、この波長では水の吸収が温度に依存するからです。マイクロプレートとcuvetteの測定がまったく同じ温度で行われない場合、光路長測定には誤差が生じます。SpectraMaxマイクロプレートリーダーは、温度等温点に近い1000 nmで水の吸光度を測定することにより、温度依存性を回避します。

この方法には、吸光度の最大値ではなく吸光曲線の傾斜部分で測定を行うため、機器に対してより高い波長再現性が求められるという代償があります。上式の比を用いると、マイクロプレートウェル内の水性サンプルの吸光度（下の例では280nmのタンパク質）は、以下のように1cmの光路長に「補正」することができます：

プリインストールされたWater Constant：ショートカット

近赤外域で吸光度する物質は比較的少ないため、上式の(A 1000 - A900)1.0 cm水溶性溶媒量は、水溶液の場合、実質的に定数であり、「Water Constant」と呼ばれます。各SpectraMaxマイクロプレートリーダーのWater Constantの値は、装置の製造時に決定され、装置のファームウェアにプリインストールされています。UV/VIS 領域の吸光度値を補正する式に、Water Constantを(A1000 – A900)_{1.0 cm aqueous solvent} に代入すると、次のようになります：

SpectraMaxマイクロプレートリーダーによる光路長補正

経路長を補正する2つの方法

SpectraMaxマイクロプレートリーダーでは、経路長補正測定を行う際に2つのオプションがあります： 1) 機器のcuvetteポートに入れたクリーンな1cmのリファレンスキュベットに水性溶媒を入れ、インストゥルメンテーションがcuvetteのA1000とA900に基づいて計算する方法（cuvetteポートを備えたリーダーのみ利用可能）、または2) Water Constantを使用する方法。cuvetteリファレンスが必要なのは、サンプル溶媒が0.5 Mを超える塩類または溶質の場合、有機溶媒を含む場合、NIRで異常な吸光度を示す場合のみです。Water Constantを使用すると、精度が低下する可能性があります。

SoftMax® Proソフトウェアでは、1cmの光路長に「補正」した吸光度測定値のレポートに加えて、96ウェルそれぞれの光路長をレポートすることができます。この機能は、マイクロプレートの容量の不規則性をスクリーニングしたり、ピペッティングエラーをチェックするのに便利です。PathCheckで吸光度読み取りを行う場合、SoftMax Proソフトウェアは以下の一連の計算を行います：

1. プレートバックグラウンドODの減算（Data Reductionで選択した場合）。
2. 光路長補正（NIR測定値の比を使用）。
3. プレート／グループブランクの減算。(もしあれば）。
4. ユーザー指定のカスタムデータ削減（もしあれば）。

PathCheckの使用

準備

材料

1. SpectraMaxマイクロプレートリーダー
2. 高品質のUV透明マイクロプレート（石英またはUV透明ポリマーなど
3. ピペッターとマイクロプレート用に適したチップまたはトランスファーピペット
4. サンプル（各100～300 µL）

PathCheck を使用するための SoftMax Pro ソフトウェアのセットアップ

1. SoftMax Proソフトウェアを起動し、Plate Sectionを開くか、必要に応じて新しいPlate Sectionを作成します。
2. 表1に示すようにInstrument Settingsを設定します。目的のwavelengthでendpoint測定を実行するよう選択します。［PathCheck box］をクリックしてマークを付け、［Water Constant］または［Cuvette Reference］ボタンをクリックします。注：［Cuvette Reference］は、cuvetteポートのある機器を使用している場合にのみ使用できます。
3. Template Editor を使用して、マイクロプレート内の標準品と未知検体の位置を示すテンプレートを作成します。
4. ツールバーのData Reduction ボタンをクリックし、Data Reduction ダイアログボックスを表示します（図 2）。Apply PathCheck（パスチェックを適用する）」の横のボックスにチェックを入れます。Plate Background ODを使用する場合は（ウェルが同一容量でない場合は必ず使用します）、'Apply Plate Background OD'の横のボックスにチェックを入れ、値を入力します。(Raw Data Mode）を光学濃度（Optical Density）に設定します。Wavelength Options（波長オプション）を設定します。

表1：PathCheckで吸光度を読み取るための機器設定。

プレートのバックグラウンド OD 測定

クリーンな96ウェルマイクロプレートの各ウェルに100～200μLの脱イオン水をピペッティングします。水は190～900 nmの間で光をほとんど吸収しないので、量は重要ではありません。SpectraMaxマイクロプレートリーダーでアッセイに使用する波長の吸光度を測定し、全ウェルのOD値を平均してプレートバックグラウンドODを求めます。この値をData Reductionダイアログボックスに入力します（図2参照）。

Cuvetteリファレンスを使用した光路長補正

注：Cuvetteリファレンスは、cuvetteポートを備えたSpectraMaxマイクロプレートリーダーのみで使用できます。

1. 上記の詳細に従って、PathCheckを使用するようにSoftMax Proソフトウェアを設定します。機器の設定で「cuvetteリファレンス」を選択します。
2. 蒸留水または水性サンプル溶媒を封じ込めた清潔な石英製またはガラス製のcuvetteをリーダのcuvetteポートにセットします。プラスチック製cuvetteも一般的に使用できますが、特定のcuvetteの性能はアッセイで使用する前に確認する必要があります。
3. アッセイプレートをプレートリーダープレートキャリッジにセットし、[Plate]セクションの[Read]ボタンをクリックします。

プレートの読み取りと同時にcuvetteも読み取られ、その NIR 吸光度値が PathCheck の計算に使用されます。注意：蒸発によるエラーを避けるため、マイクロプレートにサンプルを入れてから数分以内に読み取りを行います。読み取りを遅らせなければならない場合は、粘着シールでプレートを覆います。プレートを読み取る直前にシールを剥がしてください。

Water Constantを用いた光路長補正

注：cuvetteポートのないSpectraMaxマイクロプレートリーダーの場合、PathCheckの計算ではwater constantが自動的に使用されるため、機器設定にwater constantオプションは表示されません。

注意：蒸発による誤差を避けるため、検体をマイクロプレートに入れてから数分以内に読み取りを行ってください。読み取りを遅らせなければならない場合は、粘着シールでプレートを覆ってください。プレートを読み取る直前にシールを剥がしてください。

PathCheckを使用したマイクロプレートのピペッティングエラー検出

実験結果

実験デザインとcuvetteの結果

SpectraMaxマイクロプレートリーダーとPathCheckの性能を説明するために、黄色のpH 7緩衝液（Ricca Chemical Companyなど）を使用しました。この緩衝液の吸光度は 426 nm に極大を示します。バッファーを、Greiner 96 ウェルクリアマイクロプレートの各ウェルに 75～300 µL の量でピペッティングし、PathCheck を用いて吸光度を測定し、1 cm の光路長に正規化しました。

注：75 µL はウェルあたりの推奨最小容量より少ないが、限界容量で生じる変動を説明するために含めました。

ツールバーの「New Cuvette Set」をクリックしてcuvetteセットを作成し、「Cuvette Set Template」ダイアログボックスで、「Cuvette」という新しいグループを作成しました。

Cuvette Setの設定では、426 nm のendpoint測定が指定されています。ガラス製Cuvetteに脱イオン水を入れ、SpectraMaxマイクロプレートリーダーのCuvetteポートにセットしました。ツールバーの'Ref'ボタンをクリックし、Cuvetteの参照読み取りを行いました。次に、cuvetteを黄色のバッファーが入った適合Cuvetteと交換し、黄色のバッファー の吸光度を 3 回読み取りました。図 7 に、Cuvette SetとGroup Tableの吸光度の結果を示します。この結果から、標準 1 cm Cuvetteの 426 nm における黄色バッファーの吸光度は 0.556 であることがわかります。

プレーティングバックグラウンド OD は、その後の試験に使用し、以下のように測定しました。クリーンな96ウェルプレートの各ウェルに脱イオン水150μLをピペッティングしました。吸光度をSpectraMaxマイクロプレートリーダーで426 nmで読み取り、すべてのウェルのOD値を平均して0.039としました。この値をData Reductionダイアログボックスに入力しました（図2参照）。

同じロットの 2 枚目のマイクロプレートに、テンプレート（図 8）に示されているように、ウェル当たり 75 µL から 300 µL の範囲で黄色のバッファーをピペットで注入しました。前の検査で使用したcuvetteをcuvetteポートに残し、そのcuvetteをリファレンスとしてプレートを読み取りました。

経路長補正なしで表示されたプレーティング光学濃度

図9は、Data ReductionダイアログボックスでPathCheckの選択を解除した場合の結果です。プレート断面はカラーマップとして表示され、視覚化しやすくなっています。予想されるように、パスレングス補正を行わない場合、吸光度値はマイクロプレートウェル内のサンプル量が増加するにつれて増加します。ソフトウェアで計算された平均OD値は、75 µLグループの0.17から300 µLグループの0.52の範囲です。

経路長補正で表示されたプレーティング光学濃度

図10は、同じデータセットにPathCheckを適用したものです。プレートの断面がカラーマップで表示され、パスレングス補正後のOD値も表示されています。すべてのサンプル量について、補正後の値はcuvetteの値に近くなっています。

パスレングス補正で表示されたプレーティング光学濃度

図10は、同じデータセットにPathCheckを適用したものです。プレートの断面がカラーマップで表示され、経路長補正後の OD 値も表示されています。すべてのサンプル量について、補正後の値はキュベットの値に近くなっています。

絶対経路長（センチメートル単位）で表示されたプレーティングデータ

図12は、同じデータセットを絶対パス長で表示したものです。驚くことではないですが、データのカラーマップ表示は、ローOD値を表示した図10と似ています。計算された平均経路長は0.23cmから0.88cmの範囲でした。

データを1つのグラフにまとめます

図12では、波長426nmにおける吸光度を、波長補正の有無にかかわらず、波長（cm）の関数としてプロットしています。予想されるように、補正なしの吸光度値は光路長が長くなるにつれて（すなわちウェル内の体積が大きくなるにつれて）増加します。PathCheckを適用すると、補正後の吸光度値はほぼ同じになります。

ディスカッション

アドバイスと注意事項

適切な手順で光路長補正測定を行った場合、その値は同じ溶液を 1cm cuvetteで測定した値の 2.5%以内でなければなりません。誤った結果の原因となる可能性があるのは、蒸発とプレーティングバックグラウンド OD の失敗です。

蒸発

経路長補正の式を思い出してください：

蒸発が起こると、分母の(A₁₀₀₀ - A₉₀₀)サンプルの値が減少し、過補正が進行します。(UV/VIS領域の測定値は、分析物が揮発性でない限り変わりません)。この影響は、容積の小さいウェルで特に顕著です。ウェルに300 µLの溶液が封じ込められ ていても、蒸発の影響は15分以内に顕著に現れます(±1%の誤差)。蒸発による誤差を避けるには、マイクロプレートに検体を入れてから数分以内に測定してください。読み取りを遅らせなければならない場合は、粘着シールでプレートを覆い、読み取る直前にシールを剥がしてください。

適切なバックグラウンド補正を行わなかった場合

PathCheck を使用してサンプルを通過する経路長を補正する場合、 SoftMax Pro ソフトウェアは以下の一連の計算を行います：

1. 生の吸光度値からプレートのバックグラウンドODを差し引きます。
2. 光路長補正（NIR測定値の比を使用）。
3. プレート/グループブランクの減算（ある場合）。
4. ユーザー指定のカスタムデータ削減 (もしあれば)。

Plate Background ODの目的は、必ずしもマイクロプレートのウェル間のばらつきを補正することではなく、パスレングス補正を適用する前にプレート材料に起因する吸光度を差し引くことです。プレートのバックグラウンドODを計算するには、ウェルに水を入れた状態でプレートを読み取る必要があります。水で読み取ったウェルは、一般に乾燥したウェルよりも吸光度が低くなります。したがって、乾いたプレートを使用してプレートバックグラウンド OD を求めると、経路長補正後の吸光度値はキュベットの値よりも低くなります。プレートバックグラウンドODを完全に省略した場合、経路長補正後の結果は著しく高くなります。

干渉の可能性

光路長補正は水溶液での使用を想定していますが、少量の有機溶媒であれば、cuvetteリファレンスで光路長補正を行った場合でも許容されます。上述したように、パスレングス補正測定にはcuvetteリファレンスを使用することを強く推奨します。ただし、サンプル溶媒に高濃度（0.5 M以上）の塩やその他の溶質が含まれていたり、有機溶媒が含まれていたりすると、NIR吸光度ソリューションの値が水と異なる場合があります。このような場合、水定数は適切ではなく、サンプル溶媒を封じ込めたcuvetteリファレンスを用いて光路長補正測定を行うことが不可欠です。

NIR吸光度を用いた光路長補正は、サンプル中に測定を妨害するものがない限り適切です。濁りは干渉の原因の一つです。また、1000nmと900nmに微分吸収を持つ分子は、十分な濃度で存在すれば干渉します。900～1000 nmに吸収を持つ生物製剤はほとんどないですが、プタロシアニン、クロロフィル、カロテノイド、フィコビリンのような高度に共役した分子や、ミオグロビン、ヘモグロビン、ペルオキシダーゼのようなポルフィリン含有分子や関連分子による干渉が予想されます。還元型ホスホモリブデン酸錯体も900～1000 nmで吸収します。しかし、このような溶液でも、干渉物質が十分に希釈されており、その近赤外吸収が水に対して取るに足らないものであれば、経路長補正を適用することができます。干渉種がすべてのサンプルに一定濃度で存在する場合は、干渉種を含むサンプルをリファレンスキュベットに入れることで、干渉を除去することもできます。

結論

PathCheck®テクノロジーは、マイクロプレートの各ウェルにおける経路長を決定し、吸光度値を1cmの経路長に自動的に正規化することで、マイクロプレートにおける可変経路長の問題を克服します。PathCheckは1000nmの水の吸光度を利用し、温度に依存しない結果を保証します。PathCheckは、核酸、タンパク質、およびその他の分析物の吸光度ベースの直接定量法、および信頼性の高い結果を得るためのピペッティングエラーの検出に使用できます。

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