Application Note SpectraMax iD5・i3xでの
Transcreener TR-FRETアッセイ最適化設定

ハイスループットスクリーニングに対応したシングルアディション・ミックスアンドリード形式のアッセイです
赤色トレーサーと時間分解測定により、蛍光化合物による干渉を最小限に抑えます
10 μM ATPの10％変換でZ’因子は0.7以上です

PDF版（英語）

Joyce Itatani｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
Cathy Olsen｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

はじめに

Transcreener® HTSは、ヌクレオチドの検出に基づく汎用的なハイスループット生化学アッセイプラットフォームです。ヌクレオチドは、細胞内の数千種類の酵素によって生成され、その多くは細胞シグナル伝達の中心となる共有結合性の制御反応を触媒し、創薬ターゲットとして非常に価値があります。

Transcreener® TR-FRETアッセイは、Far-red蛍光を用いた時間分解FRET（TR-FRET）読み出しによるヌクレオチドの直接検出を行う、ワンステップの競合免疫アッセイです。すべてのアッセイ試薬は、Far-redトレーサーと高特異性モノクローナル抗体-テルビウム（Tb）コンジュゲートで構成されています。紫外領域（約330 nm）でテルビウム複合体を励起すると、トレーサーへのエネルギー移動が起こり、665 nmで発光します。ターゲット酵素によって生成されたヌクレオチド二リン酸または一リン酸は、抗体からトレーサーを置換し、TR-FRETの減少を引き起こします（図1）。赤色トレーサーの使用により、蛍光化合物や光散乱による干渉が最小限に抑えられます。Transcreener TR-FRETアッセイは、シングルアディション・ミックスアンドリード形式で、ハイスループットスクリーニング（HTS）に特化して設計されています。

図1. Transcreener TR-FRETアッセイの原理。この競合アッセイは、ドナー標識抗体と蛍光標識トレーサーを使用します。アナライトが存在しない場合、FRETが発生します。アナライトが存在すると、トレーサーが抗体から競合的に外れ、FRETが阻害されます。

バリデーション基準

Transcreener HTSアッセイの利点を最大限に活かすためには、データ読み出しに使用するマイクロプレートリーダーの正しい設定が重要です。フィルターやその他のコンポーネントを含む適切な機器設定の選択は、アッセイの感度に影響します。Transcreener HTSアッセイ性能の主要な機器パラメータは、酵素反応を模倣する10 μM ATP/ADP標準曲線（24リプリケート）を実行することで特定しました。10 μM ATPから開始し、ADPを増加させながらATPを比例的に減少させ、アデニンヌクレオチドの総濃度を10 μMに維持しました。フラッシュ回数を変化させ、Z’ > 0.5の要件を確認しました。ATPの10％変換でZ’ > 0.7を達成した場合、その機器はTranscreener TR-FRETアッセイに適合と見なされます。

材料

Transcreener ADP² TR-FRET Red Assay
ATP/ADP混合液：10 mM MgCl₂、20 mM HEPES、0.01% Brij-35、ATP/ADP（アデニン濃度を10 μMに維持）
ADP検出混合液：1X Stop and Detect Buffer C、8 nM ADP²抗体-Tbコンジュゲート、26.8 nM ADP HiLyte 647トレーサー
High FRET混合液：8 nM ADP²抗体-Tbコンジュゲート、26.8 nM ADP HiLyte 647トレーサー、1X Stop and Detect Buffer C、10 μM ATP
Low FRET混合液：8 nM ADP²抗体-Tbコンジュゲート、26.8 nM ADP HiLyte 647トレーサー、1X Stop and Detect Buffer C、10 μM ADP

標準曲線のセットアップ

各ATP/ADP組み合わせの10 μLを384ウェルプレートの全列に分注します。
それらの列にADP検出混合液10 μLを添加します。
10 μM ATP/0 μM ADP組み合わせの10 μLを列Pに分注します。
High FRET混合液10 μLをウェルP1-P12に分注します。
Low FRET混合液10 μLをウェルP13-P24に分注します。

詳細な標準曲線の調製手順については、該当するTranscreenerテクニカルマニュアルをご参照ください（https://www.bellbrooklabs.com/technical-resources/technical-manuals/）。

マイクロプレートリーダー

SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス　#ID5-STD）に以下を搭載：
◦TRF Enhancement Module for enhanced TRF reads（モレキュラーデバイス　#0200-7030）
◦Filter 320/100（モレキュラーデバイス）
◦Time Resolved Filter with holder 616nm BW 10nm（モレキュラーデバイス　#6590-0118）
◦Time Resolved Filter with holder 665nm BW 10nm（モレキュラーデバイス　#6590-0121）
SpectraMax i3x® マルチモードマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス #I3X）に以下を搭載：
◦TR-FRET測定カートリッジ（モレキュラーデバイス）

装置設定

SpectraMax iD5およびSpectraMax i3xプレートリーダーは、SoftMax® Pro データ取得・解析ソフトウェアを使用します。以下の手順に従って、最適化された設定を行ってください。

SoftMax Proソフトウェアを開き、Read Modeで「TR-FRET」、Read Typeで「Endpoint」を選択します。SpectraMax i3xプレートリーダーでは、Optical Configurationとして「HTRF（カートリッジ）」を選択してください。
SpectraMax iD5プレートリーダーでは、320/100励起フィルターと616/10および665/10発光フィルターを装着し、ExcitationおよびEmissionのドロップダウンメニューからこれらのフィルターを選択します。SpectraMax i3xプレートリーダーでは、HTRFカートリッジを装着し、HTRFを選択すると波長は自動的に設定されます。
Plate TypeとRead Areaは、使用するマイクロプレートと読み取り対象のウェルに基づいて選択してください。標準曲線の場合、マイクロプレートの全ウェルを読み取ります。
PMTおよびオプション設定：Flashes per Read（またはPulses per Read）を20～100に設定します（ここで示す結果では50を使用）、測定ディレイを0.05 ms、積分時間を0.7 msに設定します。
マイクロプレートと読み取り高さは、マイクロプレートのロットや使用するアッセイ容量ごとに最適化してください。

同じ機器設定は、容量、マイクロプレートロット、トレーサー、濃度が同一である限り、後続のプレート読み取りにも使用できます。表1に上記の設定をまとめています。

	SpectraMax iD5プレートリーダー	SpectraMax i3xプレートリーダー
Optical configuration	N/A	HTRF (cartridge)
Read mode	TR-FRET	TR-FRET
Read type	Endpoint	Endpoint
Wavelengths	Select ‘Use Filter’ for both Ex, Em. Excitation: 320 nm Emission 1: 615 nm Emission 2: 665 nm	Excitation: 320 nm Emission 1: 615 nm Emission 2: 665 nm
Plate type	384 Well Corning low vol/rnd btm	384 Well Corning low vol/rnd btm
PMT and optics	Flashes per read: 50 Excitation time: 0.05 ms Measurement delay: 0.05 ms Integration time: 0.7 ms Read height: 5.53 mm from the plate	On-the-fly detection: Off – Stop and Go Number of pulses: 50 Excitation time: 0.05 ms Excitation time: 0.05 ms Integration time: 0.7 ms Read height: 6.46 mm from the plate
More settings	Show Pre-Read Optimization options

表1. SpectraMax iD5およびi3xプレートリーダーの推奨設定。マイクロプレートと読み取り高さは、各ロットやアッセイ容量に応じて最適化してください（SoftMax Proソフトウェアの機器設定で「Show Pre-Read Optimization」オプションを使用）。

結論

本検証では、SpectraMax iD5およびSpectraMax i3xプレートリーダーがTranscreener ADP2 TR-FRET Redアッセイに適合することを示しました。最適化された機器設定を使用することで、Z’値 > 0.8が達成可能です（表2）。両機器とも、ATP変換率2%以上でバリデーション基準であるZ’値0.7を超え（図2）、ATP変換10%でZ’ > 0.7という最低要件を上回りました。

	Z’ at 10% ATP conversion
Flashes (pulses) per read	SpectraMax iD5プレートリーダー	SpectraMax i3xプレートリーダー
10	0.84	-
20	0.87	-
50	0.87	0.84
100	0.86	0.83

表2. 異なるプレートリーダー設定でのアッセイ性能

図2. A）標準曲線で観察されたZ’値は、10 μM ATPからADPへの変換を模倣しています。B）標準曲線の0～2 μM ADP領域の拡大図では、Z’バリデーションの最小基準データ（赤点線）とATP変換10%のバリデーションポイント（黒点線）を示します。青プロットはSpectraMax iD5リーダー、緑プロットはSpectraMax i3xリーダーのデータで、いずれも積分時間50 msを使用しています。

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