Application Note SpectraMaxパラダイム・プラットフォームと
TUNEテクノロジーによる蛍光タンパク質の
最適波長スキャニング
- あらゆる蛍光ラベルに対して優れた感度
- フレキシブルな波長スキャンオプション
- 特許取得済みSpectral Optimization Wizardによる効率的なアッセイ最適化
PDF版（英語）
はじめに
Molecular DevicesのSpectraMax® Paradigmマルチモードマイクロプレートリーダー（波長可変（TUNE）検出カートリッジ付き）は、波長スキャンの柔軟性とフィルターの高感度を兼ね備えています。TUNE検出カートリッジは画期的なモノクロメーター設計を採用しており、研究者は幅広い波長範囲にわたってアッセイを簡単に最適化することができます。励起は360 nmから790 nmまで、Emissionは400 nmから850 nmまで、1 nm単位で設定できる。TUNEは、時間分解蛍光および発光検出の追加機能を提供し、幅広いアッセイに対応します。
特許取得済みのスペクトル最適化ウィザードは、バックグラウンドに対するシグナルを自動的に計算し、スキャンした蛍光色素に最適な励起および発光波長を決定することで、ワークフローを簡素化します。ヒートマップは、スキャンされた波長ペアのSB比の計算結果をグラフィカルに表示し、ユーザーは自動的に最適化された波長を使用してアッセイを読み取ることができるため、単に励起と発光のピーク波長を使用する場合と比較して、EGFP検出の感度が80倍向上する。
励起・発光スペクトルスキャン
2種類の緑色蛍光タンパク質について、個別の励起・発光スペクトルスキャンを行った。組換え野生型GFP（Clontech）と増強型GFP（EGFP、BioVision）をともにTEバッファー（pH8）で10 mg/mLに希釈し、GFPサンプル（50 mL）を黒色384ウェルマイクロプレートにピペッティングしてスペクトル特性を測定した。参考のため、緩衝液のみを封じ込めたブランクウェルも用意した。
個々のExcitationおよびEmissionスペクトルスキャンでは、積分時間を140 msに設定した。励起スキャンでは、励起波長を530 nmに設定し、励起スペクトルを360 nmから500 nmまで2 nm刻みでスキャンした。発光スキャンでは、励起波長を440 nmに設定し、発光スペクトルを470 nmから600 nmまで2 nm刻みでスキャンした。EGFPの励起ピークは394 nmから482 nmにレッドシフトしていることが示されたが、発光ピークは506 nm（GFP）と512 nm（EGFP；図1）で同様のままであった。
図1. SoftMax® Pro 6ソフトウェアのTUNEとスペクトル設定を用いて得られたGFPとEGFPのスペクトル。2つのオワンクラゲ
GFP変異体の励起極大のシフトを調べた。破線は励起スペクトル、実線は発光スペクトル。
スペクトル最適化ウィザード
SoftMax® Pro 6ソフトウェアのSpectral Optimization Wizardを使用して、GFPおよびEGFPの検出に最適な波長を決定した。Spectral Optimization Wizardの選択を図2に示す。最適化を実行するための設定と波長範囲の例を図3に示す。
図2. スペクトル最適化ウィザード。SoftMax® Pro 6ソフトウェアでTUNEカートリッジのSpectral Optimization Wizardを選択する。スペクトル最適化ウィザードを使用するには、エンドポイント測定タイプを選択する必要があります。
図3. 波長範囲。スペクトル最適化ウィザードで波長範囲とインクリメントを選択する。
スペクトル最適化ウィザードは、励起とEmissionを同時にスキャンし、各励起/Emission波長ペアについて、以下の式を用いてSignal to Backgroundを計算します： (シグナル-バックグラウンド）/バックグラウンド。結果はヒートマップで表示され、最も高いSB比を示す励起/発光波長ペアは十字アイコンで強調表示されます。GFPとEGFPの結果を図4に示す。
図4. スペクトル最適化ウィザードで最適化された励起と発光の結果。ヒートマップとGFP（A）とEGFP（B）の最適化された励起と発光の波長を示す。Wavelength最適化ウィザードによって決定された最適化波長は、GFPでは励起405 nm、エミッション510 nm、EGFPでは励起465 nm、エミッション515 nmであった。
表1に示すように、Wizardで最適化された波長を用いると、GFPバリアントの検出感度が向上する。励起ピーク波長と発光ピーク波長が112 nm離れているGFPでは、励起ピーク波長と発光ピーク波長の代わりにWizard最適化波長を使用することによる感度の向上はわずかである。しかし、励起と Emissionのピーク波長が30 nmしか離れていない EGFPの場合、Spectral Optimization Wizardによって計算された最適波長を用いると、感度が80倍以上向上する。最適な励起波長とEmission波長は50 nm離れているため、散乱励起光による干渉が減少する。
まとめ
TUNE Spectral Optimization Wizardは、任意のフルオロフォアに最適な波長ペアを自動的に特定することで、ユーザーが新しいフルオロフォアの波長を最適化するのに必要な時間を少なくとも50%短縮します。励起波長360-790 nm、Emission波長400-850 nmの範囲で、TUNEは最も一般的に使用されるすべてのフルオロフォアを検出することができます。TUNEに最適化された波長は、ストークスシフトが狭いフルオロフォアを使用するアッセイに最大の利点をもたらし、上記で実証されたように、EGFP検出の感度を80倍向上させることができる。蛍光強度に加え、TUNEは時間分解蛍光および発光検出モードを提供し、アッセイの多様性を拡大する。
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