Application Note SpectraMax GEMINIおよびSoftMax Proを用いた
ナローストークスシフト蛍光体の励起および発光波長の最適化

はじめに

SpectraMax Gemini マイクロプレートリーダーを用いた励起波長と Emission 波長の最適化の基本戦略は、MAXline アプリケーションノート No.30 に概説されています。最も簡単なケースは、蛍光体のストークスシフトが比較的大きい場合（> 80 nm）で、最適な波長は、バックグラウンド干渉がないと仮定して、最大シグナルを与える波長です。ストークスシフトが狭い場合、散乱励起光が蛍光シグナルを妨害するため、選択/最適化プロセスは単純ではありません。以下のアプリケーションノートでは、ストークスシフトが80 nm未満の蛍光体に対する最適化手順の詳細と、選択プロセスを支援するためのSoftMax Proのカスタム式をご紹介しています。この例で使用されている蛍光体はフルオレセインです。

概要

アプリケーションノートNo.30に記載されているように励起スキャンを行い、励起λmaxを記録します。ストークスシフトが80nm未満の場合、推奨される励起波長はλmaxではありません。その代わりに、励起光のキャリーオーバーは減少しますが、十分な蛍光シグナルが残るような、λmaxより低い波長が選択されます。最初の反復では、モレキュラーデバイスは最大 90% の RFU が得られる可能な限り低い波長を使用することを推奨しています。次に、1つ以上のカットオフフィルターを用いて、エミッションスキャンとバックグラウンドスキャンを行います。シグナル/バックグラウンド対波長のプロットが作成され、可能な限り高いシグナル/バックグラウンド比をもたらす発光波長とカットオフフィルターの組み合わせの選択に役立ちます。

PBS、PH8.5中のフルオレセインを用いた最適化手順の例

励起スキャン

フルオレセイン溶液（PBS中10 nM、pH 8.5）をマイクロプレートウェル（200 µL/ウェル）に4回反復して分注し、PBSのみを他のウェルに分注してブランクとしました（以下の考察では「バックグラウンド」と呼ぶ）。文献値に基づいて、Emission Wavelengthを540 nmに初期設定した。カットオフフィルターなしで励起スキャンを行ったところ、488 nmにピークが認められました（図1）。

励起波長の選択

励起／エミッションの分離は明らかに80 nm未満であったため、λmaxより低いwavelength（482 nm）が選択されました。SoftMax Proは、λmaxが最良の選択ではないと自動的に判断し、90％の最大RFUを与える最低のexcitation wavelengthを計算しました。詳細な手順とカスタム式を以下に示します。

Excitation OptimizationというグループがTemplate Editorで作成され、フルオレセインサンプルがそれに割り当てられました。図2に示しますように、元のGroup tableを修正し、新しいカラムとサマリーを含むように拡張しました。Ex. lambda Maxカラムは、ウェル内の蛍光シグナルが最大となるexcitation wavelengthを示します。RFU max および 90%MAX RFU の列は 一目瞭然です。Max.Index列には、最大RFUが発生した開始wavelength（455 nm）より上のwavelengthの増分が封じ込められ、SoftMax Proがwavelengthと最大RFU値をリンクさせるために使用します。最後の列（Lambda at 90% Max）には、90%最大RFUに対応するwavelengthが含まれています。

実際のexcitation wavelengthの選択はグループテーブルの下のサマリー行で行われます。図2の列とサマリーで使用されているカスタム数式を以下の表1に示します（詳細については、SoftMax Pro Formula Reference Guideを参照）。S#1の「val」という用語は、emission wavelengthをテキストから数値に変換します。final summary（S#5）には、wavelengthを選択するための条件式が含まれています。Excitation/Emissionの差が80nm以下であれば、選択されるwavelengthはS#3であり、そうでなければS#2です。フルオレセインを用いたこの例では、Excitation/Emissionのwavelength差が80nm未満であったので、選択されたexcitation wavelengthは482nmです。

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表1： Excitation Optimization tableの計算式 注：ストークスシフトが極端に狭い蛍光体の場合、90％最大RFUよりもさらにexcitation wavelengthを短くする必要がある場合があります。

発光スキャン

excitation wavelengthとして482 nmを選択し、a)no cutoff filter（Emscan1）、b)515 nm cutoff（Emscan2）、c)530 nm cutoff（Emscan3）を用いて、emission scans（500 - 580 nm）を行いました。図3に示しますように、異なるスキャンを重ね合わせることができるように、All wavelengthsでスキャンを開始することが必須でした(同じwavelengthで開始しなかった場合、RFU値がwavelengthに対応しないため、プロットに誤りが生じます)。次のセクションでは、SoftMax Proでスペクトルプロットを重ね合わせる詳細な手順をご説明します。

SoftMax Proカスタム式を使用し、Raw Spectral Dataを含めたGroup Tableの作成

図3に示しますように、異なるスキャンからのplotを重ね合わせるために、個々のウェルからのRaw Spectral Dataを含めたGroup Tableを作成しました。Group Tableは人工的なもので、通常のSoftMax Proの目的であるサンプル情報とウェルの位置をリンクさせるために使用されたものではありません。その代わりに、SoftMax Proの特別なプレートアクセサリーを使用して、異なるプレートやウェルの個々のウェルからの生のスペクトルデータを列に入れました（SoftMax Pro Formula Guideドの第4章の「Kinetic and Spectrum Data Accessors」をご参照）。この例では、EmOptという名前のグループが作成され、 emission scan platesの1つのウェルが割り当てられました。(プレートとウェルの位置の選択は重要ではなく、単にGroup Tableを作成するために必要な割り当てでした)。

Wavelengthと呼ばれる列には、Emissionスキャンから読み取られた個々のwavelengthがリストアップされています。これはEmscan2プレートから得られたものです（しかし、どのEmissionスキャンでも可能です）。Sig515という列は、Emscan2プレート（515 nmのカットオフフィルターを使用）のフルオレセインを封じ込めたウェル（F2）の対応するRFU値をリストアップしています。同様に、Bkg515 columnには、同じスキャンのPBS含有ウェル（B1）のRFU値が記載されています。Sig/Bkg515 columnは、各wavelengthにおける前の2つのcolumnの比を示します。他のスキャンの計算式は、プレーティングがno cutoff filterのEmscan1と530 nm cutoff filterのEmscan3である以外は同様でした。列の作成に使用した計算式の例を表2に示します。

表2： Formulas for emission optimization（部分リスト）

Emission Plotsのオーバーレイ

wavelength columnをX変数、Sig515、Sig530、Sig.NoCutoffの列をY変数として、SoftMax ProのGraph sectionにemission plotsを重ね合わせました。予想通り、cutoff filterはピークをより長いwavelength（no cutoff filterの513 nmと比較して、525 nmと539 nm）にシフトさせ、その強度を低下させました（図3）。 background scansも同様に、Bkg515とBkg530列をY変数として選択し、2番目のGraph section（図5）にplotしました。約550 nm以下では、515 nmのcutoff plotは530 nmのcutoff plotより明らかに高いです。その領域より上では、2つのplotは基本的に重ね合わせ可能でした。

Emission WavelengthとCutoff Filterの最終選択

Signal/background plotsを作成し、最も高い比率を与えるemission wavelengthsとcutoff filtersの組み合わせを特定するのに役立てました。このplotから、wavelengthとfilterの組み合わせが複数あることがわかりました。（図6）。515 nmのcutoff filterでは、ほぼ同等の選択肢が2つありました： 520-525 nmと約550 nmです。530 nmのcutoff filterでは、最適な領域は約545 nmでした。このように、いずれかのwavelengthで干渉の可能性があるサンプルに対応するために、いくつかの選択肢がありました。このような柔軟性は、multi-fluorophoreアッセイの最適化において非常に有益です。

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