Application Note SpectraMax Paradigmマイクロプレートリーダーによる
Transcreener蛍光偏光アッセイの性能最適化

はじめに

キャシー・オルセン博士｜シニア・アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

このアプリケーションプロトコルでは、SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダーをベルブルックラボの以下のアッセイで検証するために使用する最適な装置パラメータについて説明します。

• Transcreener ADP2 FP (3010)
• Transcreener AMP/GMP (3006)
• Transcreener UDP FP (3007)
• Transcreener GDP FP (3009)

Transcreener HTSは、何千もの細胞酵素によって形成されるヌクレオチドの検出に基づいた、普遍的でハイスループットの生化学的アッセイプラットフォームです。これらの酵素の多くは、細胞シグナリングの中心である共有結合制御反応を触媒し、創薬のターゲットとして大きな価値があります。

Transcreener FP アッセイは、遠赤色蛍光偏光（FP）リードアウトでヌクレオチドを直接検出するシングルステップの競合的イムノアッセイです。すべてのアッセイの試薬は、高特異的モノクローナル／ポリクローナル抗体に結合した遠赤色トレーサーです。標的酵素によって産生されたヌクレオチド二リン酸または一リン酸は、抗体からトレーサーを置換し、回転自由度を増加させ、偏光度の低下をもたらす（図1）。遠赤色のトレーサーを使用することで、蛍光化合物や光散乱による干渉を最小限に抑えることができる。Transcreener FP アッセイは、1 回の添加、ミックス＆リードのフォー マットで、HTS 用に特別に設計されている。

バリデーション基準

Transcreener HTS アッセイの利点を実現する上で重要な要素は、データ読み出しに使用するマイクロプレートリーダーの正しい設定である。装置の設定を適切に選択することで、任意のアッセイに対する装置の感度に影響を与えることができる。この種の標準曲線は酵素反応を模倣しているため、10 μM の ATP/ADP 標準曲線（24 レプリケート）を測定することで、Transcreener HTS アッセイ性能の主要な装置パラメータを同定した。10 μM の ATP から開始し、ADP を徐々に添加し、ATP をそれに比例して減少させ、アデニンヌクレオチドの総濃度を 10 μM に維持した。Z'>0.5の要件を決定するために積分時間を変化させた。トランスクリーナーFPアッセイで使用する装置を検証するためには、10μM ATPの10％変換でZ'>0.7とΔmP>120が必要であった。

材料

• ATP/ADP ミクスチャー - 4 mM MgCl2、2 mM EGTA、50 mM HEPES、pH 7.5、1% DMSO、0.01% Brij-35、および ATP/ADP (10 μM の一定アデニン濃度になるように配合)
• ADP Detection Mixture - 1X Stop & Detect Buffer B、4 nM ADP Alexa633 トレーサー、14.8 μg/mL ADP2 Antibody
• 遊離トレーサー - 1X Stop & Detect Buffer B、4 nM ADP Alexa633 トレーサー
• バッファーブランク - 1X Stop & Detect Buffer B と 14.8 μg/mL ADP2 Antibody

標準曲線の作成方法の詳細については、トランスクリーナー技術マニュアル（http://www.bellbrooklabs.com/ transcreener_hts_assays.html）をご参照ください。

測定方法

アッセイ準備

ステップ1. 各ATP/ADPの組み合わせを10μLずつ、384ウェルプレートの列全体に分注します。

ステップ2. これらの列にADP Detection Mixを10μL加える。

ステップ3. 10μM ATP/0μM ADPの組み合わせをP列に10μL分注します。

ステップ4. 10μLのFree TracerをウェルP1-P12に分注します。

ステップ5. ウェルP13～P24にBuffer Blankを10μL分注します。

装置のセットアップ

SpectraMax マイクロプレートリーダーを表 1 の設定でセットアップします。

表1. SpectraMax Paradigm装置の推奨設定

SpectraMax Paradigmプレートリーダーは、SoftMax® Proソフトウェアを使用して操作します。プロトコールライブラリから設定済みのプロトコールから開始し、説明に従って変更します。

ステップ 1. SoftMax Pro ソフトウェアを開き、'Protocol Manager'、'Protocol Library'の順にクリックし、設定済みのプロトコルにアクセスします。Paradigm Protocols」フォルダで「FP Rhodamine」プロトコルを選択します。

ステップ 2. ナビゲーションツリーの'Plate01'をクリックし、Settings（歯車アイコン）をクリックしてSettingsダイアログを開きます。

ステップ3. Cartridges メニューからAlexa Fluor 633 FP用のカスタムカートリッジを選択します。

ステップ4. Read Mode「FP」とRead Type「Endpoint」が強調表示されます。

ステップ5. 波長設定はカートリッジによって決定され、ユーザーによる変更はできません。

ステップ6. Plate Type」をクリックし、Plate Format「384 Wells」とSelect Specific「384 Well Corning low vol/rndbtm」を選択します。

ステップ7. Read Area（読み取り領域）」をクリックし、プレート図上で読み取るウェルを選択します。

ステップ8. PMT and Optics（PMTと光学系）」をクリックします。Off - Stop and Go」または「Performance - On the fly」を選択します。

ステップ9. Stop and Goを選択した場合は、積分時間を20ms以上入力してください。積分時間が長いほど一般的に性能が向上しますが、プレートの読み取りには時間がかかります。

ステップ10. 最適な読み取り高さがわかっている場合は、それを入力します。新しいアッセイやプレートタイプの場合は、読み取り高さの最適化を行う必要があります。最適化を行う場合は、読み取り高さをデフォルトの 1 mm のままにしてください。最適化が実行されると、新しい（最適な）読み取り高さがデフォルト値に置き換わります。

ステップ11. More Settings」をクリックします。プレート全体または数行の完全な行を読み取る場合は「Row」、数列の完全な列のみを読み取る場合は「Column」と、読み取り順序を選択します。

ステップ12. Show Pre-Read Optimization Options」にチェックを入れます。

ステップ13. OK」をクリックして設定ダイアログを閉じる。

ステップ14. 読み取り」をクリックします。最適化オプションを示すウィザードが表示されます。新しいアッセイに対して、マイクロプレート最適化とリードハイト最適化の両方を実行します。

表2. 様々な装置設定でのアッセイ性能

結果

サンプルFP標準曲線

ATPに対するADPの比率が増加するにつれて、結合トレーサー対遊離トレーサーの割合が減少し、その結果mP値が全体的に減少する。15 点標準曲線を含むアッセイプレートを SpectraMax Paradigm リーダーで読み取った。

結論

このアプリケーションプロトコールは、Transcreener FP アッセイと使用するための SpectraMax Paradigm リーダーの検証を示すものである。ここで提案した最適化された装置設定を利用することで、1分未満の読み取り時間でZ'値＞0.7およびΔmP＞120が達成可能である。より長い積分時間を使用することで、バリデーションの最小要件を大幅に上回る結果を得ることができ、一方、より高速なオンザフライ設定を使用することで、1分未満の読み取り時間でアッセイの要件を満たすことができる。