Application Note Transcreener蛍光偏光アッセイを
SpectraMax Paradigmで高性能化

Cathy Olsen, PhD｜シニア・アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラーデバイス

はじめに

このアプリケーションプロトコールでは、BellBrook Labs社の以下のアッセイに対して、SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダーをバリデーションするために使用する最適な装置パラメーターについて説明します：

• Transcreener ADP2 FP (3010)
• Transcreener AMP/GMP (3006)
• Transcreener UDP FP (3007)
• Transcreener GDP FP (3009)

Transcreener HTSは、数千種類の細胞酵素によって形成されるヌクレオチドの検出に基づいた、汎用性の高いハイスループット生化学アッセイプラットフォームです。これらの酵素の多くは、細胞シグナル伝達の中心となる共有結合の制御反応を触媒し、創薬において非常に価値の高いターゲットとなります。

Transcreener FPアッセイは、Far-red蛍光偏光（FP）検出を用いたヌクレオチドの直接検出のためのワンステップ競合イムノアッセイです。すべてのアッセイの試薬は、Far-red蛍光トレーサーと高特異性のモノクローナル／ポリクローナル抗体で構成されています。ターゲット酵素によって生成されたヌクレオチド二リン酸または一リン酸は、抗体からトレーサーを置換し、回転自由度を増加させ、偏光の低下を引き起こします（図1）。Far-red蛍光トレーサーの使用により、蛍光化合物や光散乱による干渉が最小化されます。Transcreener FPアッセイは、単一添加のMix-and-read形式でHTSに特化して設計されています。

バリデーション基準

Transcreener HTSアッセイの利点を最大限に引き出すための重要な要素は、データ読み取りに使用するマイクロプレートリーダーの正しいセットアップです。装置設定の適切な選択は、アッセイの感度に影響を与える可能性があります。Transcreener HTSアッセイの性能における主要な装置パラメーターは、10 μM ATP/ADP標準曲線（24リプリケート）を実行することで特定されました。このような標準曲線は酵素反応を模倣します。10 μM ATPから開始し、ADPを増加させながら添加し、ATPを比例して減少させ、アデニンヌクレオチドの総濃度を10 μMに維持します。Z’値が0.5を超えるための要件を確認するために、積分時間を変化させました。Transcreener FPアッセイに使用する装置をバリデーションするためには、Z’値が0.7以上、かつ10 μM ATPの10％変換時にΔmPが120以上であることが必要です。

材料

• ATP/ADP ミクスチャー - 4 mM MgCl₂、2 mM EGTA、50 mM HEPES、pH 7.5、1% DMSO、0.01% Brij-35、および ATP/ADP (10 μM の一定アデニン濃度になるように配合)
• ADP Detection Mixture - 1X Stop & Detect Buffer B、4 nM ADP Alexa633 トレーサー、14.8 μg/mL ADP2 Antibody
• 遊離トレーサー - 1X Stop & Detect Buffer B、4 nM ADP Alexa633 トレーサー
• バッファーブランク - 1X Stop & Detect Buffer B と 14.8 μg/mL ADP2 Antibody

標準曲線の作成手順については、該当するTranscreenerテクニカルノート（http://www.bellbrooklabs.com/transcreener_hts_assays.html）をご参照ください。

方法

アッセイ準備

ステップ1：384ウェルプレートの各行にATP/ADPの組み合わせを10 μL分注します。
ステップ2：その行にADP検出ミックスを10 μL添加します。
ステップ3：10 μM ATP/0 μM ADPの組み合わせを行Pに10 μL分注します。
ステップ4：Free TracerをウェルP1～P12に10 μL分注します。
ステップ5：Buffer BlankをウェルP13～P24に10 μL分注します。

装置のセットアップ

SpectraMax マイクロプレートリーダーを表1の設定でセットアップします。

表1. 推奨SpectraMax Paradigm装置設定

SpectraMax Paradigmプレートリーダーは、SoftMax® Proソフトウェアを使用して操作します。プロトコールライブラリから設定済みのプロトコールから開始し、説明に従って変更します。

ステップ 1. SoftMax Pro ソフトウェアを開き、「Protocol Manager」をクリックし、次に「Protocol Library」をクリックして事前構成済みプロトコールにアクセスします。「Paradigm Protocols」フォルダー内で「FP Rhodamine」プロトコールを選択します。
ステップ 2. ナビゲーションツリーで「Plate01」をクリックし、設定アイコン（歯車）をクリックして設定ダイアログを開きます。
ステップ3. カートリッジメニューで「Alexa Fluor 633 FP」用のカスタムカートリッジを選択します。
ステップ4. 「Read Mode」は「FP」、「Read Type」は「Endpoint」が選択されていることを確認します。
ステップ5. 波長設定はカートリッジによって決定され、ユーザーによる変更はできません。
ステップ6. 「Plate Type」をクリックし、Plate Formatで「384 Wells」を選択し、Specificで「384 Well Corning low vol/rndbtm」を選択します。
ステップ7. 「Read Area」をクリックし、プレート図上で読み取るウェルを選択します。
ステップ8. 「PMT and Optics」をクリックし、「Off – Stop and Go」または「Performance – On the fly」を選択します。
ステップ9. Stop and Goを選択した場合、積分時間を20 ms以上に設定します。積分時間が長いほど性能は向上しますが、プレートの読み取り時間は長くなります。
ステップ10. 最適な読み取り高さがわかっている場合は入力します。新しいアッセイやプレートタイプの場合は、読み取り高さの最適化を実施する必要があります。最適化を行う場合は、読み取り高さをデフォルト値の1 mmに設定したままにします。最適化後は、新しい（最適な）読み取り高さがデフォルト値に置き換わります。
ステップ11. 「More Settings」をクリックし、読み取り順序を選択します。プレート全体または複数の完全な行を読み取る場合は「Row」、複数の完全な列のみを読み取る場合は「Column」を選択します。
ステップ12. 「Show Pre-Read Optimization Options」のチェックボックスをオンにします。
ステップ13. 「OK」をクリックして設定ダイアログを閉じます。
ステップ14. 「Read」をクリックします。最適化オプションを表示するウィザードが表示されます。新しいアッセイの場合は、マイクロプレートの最適化と読み取り高さの最適化を両方実施してください。

表2. 各種装置設定におけるアッセイ性能

結果

サンプルFP標準曲線

ADPとATPの比率が増加すると、結合トレーサーと遊離トレーサーの比率が減少し、mP値が全体的に低下します。15ポイントの標準曲線を含むアッセイプレートは SpectraMax Paradigm プレートリーダーで測定されました。

結論

このアプリケーションプロトコールは、Transcreener FPアッセイに使用する SpectraMax Paradigm プレートリーダーのバリデーションを示しています。ここで提案する最適化された装置設定を利用することで、Z’値が0.7以上、ΔmPが120以上を達成でき、読み取り時間は1分未満です。積分時間を長くすることで、最小バリデーション要件を大きく超える結果が得られます。一方、オンザフライ設定では、読み取り時間が1分未満でアッセイ要件を満たします。