Application Note OxiSelect ORACアッセイの測定方法
SpectraMax蛍光マイクロプレートリーダー

PDF版（英語）

Cathy Olsen, PhD | Sr. Applications Scientist | モレキュラーデバイス

はじめに

活性酸素種は、通常の細胞プロセス、環境ストレス、紫外線照射によって生成されます。これには、ペルオキシルラジカル（ROO·）、ヒドロキシルラジカル（HO·）、スーパーオキシドイオン（O₂·⁻）、および一重項酸素ラジカル（¹O₂）が含まれます。酸素ラジカル吸収能（ORAC）アッセイは、生理学的体液、食品、飲料、天然製品の抗酸化能を評価するために使用される標準的な方法です。このアッセイは、細胞成分と反応して損傷を引き起こす可能性のあるフリーラジカルを消去するサンプルの能力を定量的に測定します。これにより、細胞周期に悪影響を及ぼし、がんやその他の疾患を引き起こす突然変異が発生する可能性があります。

このアプリケーションノートでは、SpectraMax® Gemini™ XPS マイクロプレートリーダーと SoftMax® Pro ソフトウェアを Cell Biolabs OxiSelect™ ORAC アッセイと組み合わせて使用し、さまざまなフルーツジュースの抗酸化能を測定する方法と、このアッセイの簡便性を紹介します。

アッセイ原理

このアッセイは、酸素ラジカル吸収物質の存在下で、2,2’-アゾビス-2-メチルプロパニミダミド二塩酸塩（AAPH）の熱分解によって生成されるペルオキシルラジカル（ROO·）が蛍光プローブであるフルオレセインのシグナル強度に与える影響に基づいています。吸収能が強いほど、ペルオキシルラジカルはより多く消去され、観察される蛍光シグナルの強度が維持されます。結果を得るために、蛍光強度と時間の曲線下面積（AUC）をブランクから差し引き、物質の抗酸化能を Trolox™ 等価値として決定します。Trolox はビタミンE類似体で、抗酸化能の標準測定に使用されます。

材料

アッセイを行うために以下の材料を使用：

Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay
SpectraMax Gemini XPS マイクロプレートリーダー
ソリッドブラックGreiner FLUOTRAC™ 200プレート
サンプル：ホワイトクランベリージュース、ホワイトグレープジュース、オレンジジュース、ザクロジュース、クランベリー・ブルーベリージュース、赤ワイン

測定方法

以下のアッセイ設定手順は、キットに付属する Cell Biolabs OxiSelect Oxygen Radical Antioxidant Capacity（ORAC）アクティビティアッセイのプロトコールに基づいています。

試薬の調製

フルオレセインプローブの調製：提供されたフルオレセインプローブを、提供されたアッセイ希釈液で 1:100 に希釈しました。均一になるまで混合し、1X フルオレセイン溶液としてラベル付けしました。

アッセイ希釈液の調製：アッセイ希釈液を脱イオン水で 1:4 に希釈し、均一になるまで混合しました。これはすべてのサンプルおよび標準の希釈に使用し、4°Cで保存しました。

サンプルの調製：ジュースおよびワインのサンプルを 4°Cで 5000～10,000 × g で 10 分間遠心し、粒子を除去しました。すべての上清は、アッセイ実施前に 100 倍および 1000 倍に希釈しました。

抗酸化標準曲線の作成

標準は、1000 μM 抗酸化標準ストック溶液をアッセイ希釈液で希釈して、最終的な濃度を得ました。必要な量のみを直前に調製しました。抗酸化標準のシリーズは、以下の表1に従って作成しました。ゼロ Trolox 標準はブランクとして扱いました。

チューブ	トロロックス酸化防止剤標準溶液（μL）	アッセイ希釈液（μL）	トロロックス濃度（μM）
501	50	950	50
2	40	960	40
3	30	970	30
4	20	980	20
5	10	990	10
6	5	955	5
7	2.5	997.5	2.5
8	0	1000	0

表1. 標準物質の調製

注記：各抗酸化標準およびサンプルは、二重または三重でアッセイする必要があります。アッセイを実施するたびに、新しく調製した標準曲線を使用してください。

結果の計算

ステップ1：SoftMax Pro ソフトウェアを使用して、各サンプルおよび標準の曲線下面積（AUC）を計算しました。

ステップ2：ブランクの AUC を各サンプルおよび標準の AUC から差し引いて、正味 AUC を計算しました。

ステップ3：正味 AUC 値を y 軸に、Trolox 抗酸化標準濃度を x 軸にプロットしました。

ステップ4：未知サンプルの μM Trolox 等価値（TE）を標準曲線に基づいて計算し、結果を μmol TE/mL のサンプルとして表しました。

結果

SoftMax Pro ソフトウェアを使用して標準曲線のグラフ化とすべてのデータ解析を行いました。Trolox 標準の動態曲線は図1に示されています。曲線下面積（AUC）はブランクについて計算され、この値を各標準から差し引いて正味 AUC を算出しました。Trolox 標準の正味 AUC 値を濃度に対してプロットし、図2の標準曲線を得ました。

図1. 異なる Trolox 濃度における動態曲線 Trolox 標準（2.5～50 μM）の代表的な動態曲線を示します。動態曲線は、ORAC 値の計算の基礎となる曲線下面積（AUC）を算出するために使用されます。

図2. Trolox 標準曲線 Trolox 標準曲線は、上記の方法で各標準の正味 AUC を計算して作成しました（r² = 0.996）。

すべてのサンプルについて正味 AUC 値を計算しました。ORAC 値は Trolox 等価値（TE）として、Trolox 標準曲線から逆算し、サンプルの希釈係数を掛けて最終的な ORAC 値を μmol TE/mL で表しました。サンプルを 1:100 に希釈した場合は標準曲線の範囲外でしたが、1:1000 に希釈したサンプルはすべて範囲内でした。1:1000 に希釈したサンプルの ORAC 値は表2に示されています。

サンプル	ORAC値（μmol TE/mL）
白クランベリージュース	15.7
ホワイトグレープジュース	21.6
オレンジジュース	19.0
ザクロジュース	25.0
クランベリー・ブルーベリージュース	22.8
赤ワイン	29.3

表2. フルーツジュースおよびワインサンプルの ORAC 値

テストしたサンプルの中で、赤ワインが最も高い ORAC 値を示し、白クランベリージュースが最も低い値を示しました。なお、異なるメーカーのサンプルを使用した場合、成分が異なるため値が異なる可能性があります。

結論

Cell Biolabs OxiSelect Oxygen ORAC アクティビティアッセイは、SpectraMax Gemini XPS マイクロプレートリーダーを使用して容易に実施できます。標準のグラフ化と結果の計算は、リーダーに付属する SoftMax Pro ソフトウェアによって自動的に行われます。

なお、SpectraMax Mシリーズ、i3x、iD3/iD5、および Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダー、さらに FilterMax™ F5 マルチモードマイクロプレートリーダーはすべて蛍光検出機能を備えており、OxiSelect ORAC アッセイにも使用できます。FlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダーは、アッセイプレートへの試薬自動添加のためのオンボードピペッティング機能も提供します。

参考文献

Huang, D., Ou, B., and Prior, R.L. (2005). The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agric. Food Chem. 53, 1841-1856.

Wang, H., Cao, G., and Prior, R.L. (1996). Total antioxidant capacity of fruits. J. Agric. Food Chem. 44, 701–705.

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